黃連素抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡

張春潔，金 平，李 娜

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)，甘肅蘭州730000;2.深圳市婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東深圳518028)

黃連素(berberine)對多種腫瘤有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［1－2］，但在卵巢癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究以人卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，觀察黃連素對SKOV3細(xì)胞增殖抑制作用及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料:黃連素(永嘉天然植物開發(fā)有限公司)。SKOV3細(xì)胞(蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)含10%胎牛血清的RPMI-1640于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR試劑(大連寶生物)。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率:將7×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，貼壁后，0、12.5、25、50、100 和200 μmol/L黃連素處理24、48、72 h，棄上清，每孔加入 MTT(5 g/L)10 μL，繼續(xù)孵育4 h，加入酸化10%十二烷基硫酸鈉100μL，次日在570 nm波長處檢測吸光度值。每組4個(gè)復(fù)孔。抑制率(%)=［1－(加藥組A值/對照組A值)］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 PI單染法檢測細(xì)胞周期分布:收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定過夜，PBS洗兩次，PI避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 Annexin V和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡:收集細(xì)胞，加入Annexin V和PI，室溫避光染色10 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡:收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片，透射電鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測基因表達(dá):收集細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)試劑盒，按照說明書先提取總RNA，再進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)和合成:參考文獻(xiàn)［3］，內(nèi)參照基因選β-actin，大連寶生物合成。

2 結(jié)果

2.1 黃連素抑制細(xì)胞增殖活性:黃連素呈藥物濃度和時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖(p＜0.05)(表1)。

表1 黃連素對SKOV3細(xì)胞生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of berberine on the growth of SKOV3 cells，%，n=3)

表1 黃連素對SKOV3細(xì)胞生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of berberine on the growth of SKOV3 cells，%，n=3)

*p＜0.05 compared with berberine 12.5μmol/L;#p＜0.05 compared with 24 hours．

berberine(μmol/L)inhibition rate 24 hours 48 hours 72 hours 0－－－12.5 7.87±1.03 15.46±0.98# 20.88±1.35#25 10.03±0.98* 20.03±1.99*# 38.63±1.82*#50 25.66±2.38* 39.96±2.94*# 51.09±2.00*#100 37.9±1.02* 50.52±1.21*# 60.13±1.94*#200 45.59±1.56* 61.33±1.39*# 75.54±1.39*#

2.2 黃連素影響SKOV3細(xì)胞周期分布:不同濃度黃連素作用后，與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，隨著黃連素濃度增加，改變愈明顯(表2)。

表2 黃連素對SKOV3細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of berberine on cycle cycle distribution of SKOV3 cells，%，n=3)

表2 黃連素對SKOV3細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of berberine on cycle cycle distribution of SKOV3 cells，%，n=3)

＊P ＜0.05 compared with berberine 0 μmol/L;＊＊P ＜0.01 compared with berberine 0 μmol/L．

berberine(μmol/L)cell cycle G0/G1 S G2/M 0 62.11±1.31 33.63±2.31 4.26±1.04 25 69.60±0.99* 28.62±1.08 1.78±0.21*50 77.86±0.22＊＊ 20.89±0.06* 1.25±0.19*100 81.49±1.52＊＊ 17.58±1.46＊＊ 0.93±0.17*200 85.54±2.21＊＊ 13.94±2.30＊＊ 0.52±0.13*

圖1 黃連素作用后SKOV3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變Fig 1 The ultrastructure changes of SKOV3 cells treated with berberine

2.3 黃連素促進(jìn)細(xì)胞凋亡:25、50、100和200μmol/L黃連素作用48 h，細(xì)胞凋亡率分別為(18.89±1.79)%、(36.11±3.01)%、(52.9±0.07)%和(62.4±0.1)%，顯著高于對照組(1.15±0.076)%(p＜0.05)。

2.4 黃連素導(dǎo)致細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變:正常SKOV3細(xì)胞膜完整，核大，無明顯染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。經(jīng)黃連素作用后，胞膜破損直至消失，核染色質(zhì)高度濃縮、邊集于核膜下，呈半月形，或出現(xiàn)核固縮和核碎裂，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡變性(圖1)。

2.5 黃連素影響細(xì)胞BCL-2、BAX和SURVIVN mRNA的表達(dá):100和200μmol/L黃連素作用48 h，基因表達(dá)量為BCL-2 0.88±0.19和0.60±0.18，SURVIVIN為0.73±0.05和0.31±0.06，二者顯著低于對照組的1;而BAX為33.44±2.75和53.19±2.66，顯著高于對照組的1(p＜0.05)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和濃度依賴性。黃連素作用后，細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組，濃度越高，凋亡率越高，并出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特征。黃連素將卵巢癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而調(diào)節(jié)G0/S轉(zhuǎn)換，使進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，周期進(jìn)程受阻的細(xì)胞，發(fā)生凋亡。

BCL-2基因家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。BCL-2主要通過與BAX形成二聚體發(fā)揮作用，二者的比例決定細(xì)胞發(fā)生凋亡與否。SURVIVIN是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，黃連素能夠下調(diào)BCL-2、SURVIVIN表達(dá)，上調(diào)BAX表達(dá)，說明黃連素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與調(diào)節(jié)BCL-2基因家族和SURVIVIN的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，黃連素對于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和影響B(tài)CL-2、BAX、SURVIVIN基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。黃連素有望成為治療卵巢癌的有效化療藥物，具有較大的開發(fā)價(jià)值。

［1］ Lee SJ，Noh HJ，Sung EG，et al．Berberine sensitizes TRAIL-induced apoptosis through proteasome-mediated downregulation of c-FLIPand Mcl-1 proteins［J］．Int J Oncol，2011，38:485 －492．

［2］Jie S，Li H，Tian Y，et al．Berberine inhibits angiogenic potential of Hep G2 cell line through VEGF down-regulation in vitro［J］．J Gastroenterol Hepatol，2011，26:179 －185．

［3］ Ahamed M，Akhtar MJ，Siddiqui MA，et al．Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells［J］．Toxicology，2011，283:101－108．