糖尿病大鼠胰腺血管緊張素受體Mas表達(dá)降低

張雪蓮，史婷婷，尚 軍，王 陽(yáng)，楊金奎*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院1.內(nèi)分泌科;2.中心實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

目前糖尿病影響到全球1.35億人口，預(yù)計(jì)到2025年將增長(zhǎng)至3億。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)與糖尿病的關(guān)系近來(lái)引起廣泛關(guān)注。除了循環(huán)RAS外，發(fā)現(xiàn)許多組織和器官存在自身的RAS，其中人們對(duì)胰腺局部的RAS尤為關(guān)注［1］。

RAS可以通過(guò)兩條不同的通路發(fā)揮作用:一條是ACE-AngⅡ-AT1受體軸，另一條是起反向調(diào)節(jié)作用的ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是RAS的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可降解血管緊張素-Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ)產(chǎn)生血管緊張素(1-7)(angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)，后者是有效的血管舒張肽，并通過(guò)與其受體Mas結(jié)合在體內(nèi)拮抗血管緊張素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)的作用［2］。Mas作為Ang-(1-7)的受體為Ang-(1-7)的生物學(xué)意義提供生化和分子生物學(xué)依據(jù)。本研究觀(guān)察糖尿病發(fā)生過(guò)程中胰島細(xì)胞Mas的變化，為Mas受體在糖尿病發(fā)病中的可能作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

48周齡雄性肥胖自發(fā)性糖尿病大鼠(OLETF)與同種系同齡糖耐量正常Long-Evans Tokushima Ostuka(LETO)大鼠各6只，由日本大冢制藥公司研究所提供，所有實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理法案。大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，在12 h明暗交替的同一環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。OLETF大鼠為O組，同種系同齡糖耐量正常LETO大鼠為L(zhǎng)組。

1.2 主要試劑

膠原蛋白酶Ⅴ和戊巴比妥鈉(Sigma公司)，含有雙抗RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(AXIS-SHIELD公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa公司)，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit Manual(北京尚柏公司)，羊抗人Mas多克隆抗體和兔抗人ACE2多克隆抗體(Santa Cruz公司)，大鼠胰島素ELISA試劑盒(BlueGene)，免疫組化染色試劑盒(Histostain-Plus Rabbit Primary，Invitrogen公司)。

1.3 大鼠一般特征

1.3.1 基本指標(biāo)測(cè)定:觀(guān)察OLETF大鼠及同種系同周齡LETO大鼠的飲食、活動(dòng)、飲水等一般情況，定期稱(chēng)量體質(zhì)量、身長(zhǎng)。

1.3.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)［3］:大鼠禁食14 h，期間自由飲水，次日稱(chēng)體質(zhì)量。取空腹尾靜脈血，灌胃給予葡萄糖(2 g/kg)，于服糖后15、30、60和120 min時(shí)取尾靜脈血。在空腹及服糖后均另用毛細(xì)管于眼眶內(nèi)眥取血。用強(qiáng)生公司One-Touch血糖儀及葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖。ELISA法檢測(cè)血清胰島素濃度。血漿生化儀測(cè)定血清三酰甘油及總膽固醇。

1.4 Mas及ACE2在大鼠胰島細(xì)胞的表達(dá)

1.4.1 胰腺標(biāo)本處理:大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉，取其部分胰腺，標(biāo)本制成4μm石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀(guān)察、拍照。

1.4.2 免疫組化方法(S-P法):按S-P免疫組化試劑盒步驟操作檢測(cè)大鼠胰腺組織切片中Mas及ACE2蛋白的表達(dá)。一抗分別為羊抗人Mas多克隆抗體，1∶50稀釋;兔抗人 ACE2 多克隆抗體，1∶50稀釋;陰性對(duì)照一抗為抗體稀釋液。按試劑盒說(shuō)明染色，加拿大樹(shù)膠封片。于顯微鏡下觀(guān)察，用圖像分析儀拍照。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色反應(yīng)顆粒。

1.4.3 胰島細(xì)胞純化:大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉，膽總管內(nèi)插管逆行注入0.5 mg/mL膠原蛋白酶V溶液，迅速摘取胰腺，移入預(yù)置Hanks液的消化瓶中。37℃水浴中靜止消化10 min，37℃水浴振蕩15 min，加入4℃的Hanks液(含10%胎牛血清)終止消化，獲得胰島細(xì)胞懸液。按照文獻(xiàn)［4］報(bào)道的人淋巴細(xì)胞分離液法進(jìn)行改良，在常溫下進(jìn)行胰島細(xì)胞的純化，后者用于QRT-PCR、Western印跡法檢測(cè)。

1.4.4 QRT-PCR檢測(cè)大鼠胰島細(xì)胞Mas mRNA的表達(dá):應(yīng)用 Trizol法抽提細(xì)胞總 RNA，測(cè)定 A260和A280，保證比值在1.8～2.0之間，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Mas引物序列，上游:5'-GGGTCTAATCGATGATG AGCTTGT-3';下游:5'-CCCGTCACATATGGAAGCA TT-3'。ACE2引物序列，上游:5'-CTCTTGGGAAA AATGCGTATGAA-3';下游:5'-GGCAACAGATGAT CGGAATAGG-3'。RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)依據(jù)TaKaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0說(shuō)明步驟進(jìn)行。用Line-gene熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，QRTPCR檢測(cè)反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)條件:預(yù)孵育95℃120 s;擴(kuò)增95 ℃ 20 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán);最后在延伸階段結(jié)束。分析方法:采用2－ddCT法。用 －ddCT代表基因的相對(duì)表達(dá)量(RQ=2－ddCT)，CT代表擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，dCT=目的基因CT值－內(nèi)參基因CT值，ddCT=待測(cè)樣本dCT－標(biāo)準(zhǔn)dCT。

1.4.5 Western blot:提取大鼠胰島細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取50μg總蛋白進(jìn)行 10%SDS-PAGE電泳，再電轉(zhuǎn)(100 V，90 min)至硝酸纖維膜上。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用封閉液將一抗按照一定比例稀釋(羊抗人Mas多克隆抗體1/200稀釋?zhuān)每谷?ACE2多克隆抗體1/100稀釋)，將膜與一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜，再與HRP標(biāo)記的二抗(1/3 000稀釋)室溫孵育2 h。同時(shí)以β-actin(HRP標(biāo)記的兔抗人多克隆抗體)作為內(nèi)參，抗體稀釋比例為1/1 000。TBST洗滌，ECL顯色，壓片，洗片。將顯色后的膜或底片照相，并用LabWorks軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠及LETO大鼠的一般特征比較

2.1.1 體質(zhì)量和身長(zhǎng)及一般情況的觀(guān)察:O組大鼠體質(zhì)量較L組顯著增加(654±15 g vs 592±12 g，p＜0.05)。每日飲水量及進(jìn)食量較L組均顯著增加(39.5±2.8)g vs(30.6±1.8)g及(19.3±1.6)g vs(11.1±1.3)g(p＜0.01)。

2.1.2 大鼠的口服葡萄糖耐量:O組大鼠的空腹血糖及服糖后15、30、60和120 min血糖水平均顯著高于同期L組大鼠(p＜0.01)(圖1)。根據(jù)OGTT血糖結(jié)果及OLETF大鼠糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):即服糖后血糖峰值 ＞16.8 mmol/L，且2 h血糖 ＞11.1 mmol/L的大鼠確定為糖尿病(DM)［3］，48周齡OLETF大鼠均達(dá)到DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 OLETF大鼠和LETO大鼠OGTT的比較Fig 1 The comparison of oral glucose tolerance in both OLETF rats and LETO rats，n=6)

2.1.3 大鼠的空腹血糖、空腹胰島素及血脂:O組大鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著高于L組(8.96±0.50)mmol/L vs(6.02±0.86)mmol/L和(1.14±0.04)ng/mL vs(0.95±0.07)ng/mL)(p＜0.05)。O組大鼠血清總膽固醇和三酰甘油水平均顯著高于 L組(2.58±0.14)mmol/L vs(2.05±0.16)mmol/L和(3.30±0.66)mmol/L vs(1.57 ±0.22)mmol/L(P ＜0.05)。

2.2 大鼠胰腺的形態(tài)學(xué)及Mas及ACE2的免疫組織化學(xué)分析

大鼠胰腺M(fèi)as及ACE2蛋白均定位在胰腺的腺腔和胰島，棕黃色為陽(yáng)性著色。大鼠胰腺胰島及外分泌腺均有Mas及ACE2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖2，3)。

2.3 鼠胰島細(xì)胞Mas及ACE2表達(dá)的定量分析

O組大鼠胰島細(xì)胞Mas mRNA水平為0.18±0.06，顯著低于 L組的0.59±0.17(p＜0.05)。O組大鼠胰島細(xì)胞ACE2 mRNA水平與L組無(wú)顯著差異(0.36±0.15 vs0.46±0.19)。

2.4 大鼠胰島細(xì)胞Mas及ACE2的蛋白水平

與L組相比，O組大鼠胰島細(xì)胞Mas的蛋白表達(dá)顯著下降(p＜0.05)。胰島細(xì)胞ACE2的蛋白表達(dá)兩組間無(wú)顯著差異(圖4)。

圖4 比較OLETF大鼠及LETO大鼠胰島細(xì)胞Mas及ACE2蛋白表達(dá)Fig 4 The comparison of islets Mas and ACE2 protein expression in OLETF rats and LETO rats by Western blot，n=6)

3 討論

近年研究表明，胰腺局部的RAS參與正常人胰腺的生理調(diào)控，應(yīng)用免疫組化方法已證實(shí)RAS在人類(lèi)胰腺內(nèi)外分泌腺體均有表達(dá)［1］。在胰腺內(nèi)分泌腺，胰島的RAS在調(diào)節(jié)葡萄糖刺激的胰島素分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。

ACE2最近被認(rèn)為是ACE的一個(gè)新的同源物，ACE2在生理狀態(tài)及高血壓、慢性心力衰竭、糖尿病及糖尿病腎病等病理生理過(guò)程中與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)互相拮抗，其作用主要通過(guò)Ang-(1-7)完成。后者是RAS中的重要肽類(lèi)，具有舒張血管、激活緩激肽、拮抗Ang-Ⅱ等作用［5］。Mas為 Ang-(1-7)受體，在心臟、睪丸、腎臟和腦等中均有表達(dá)［6］，具有G蛋白偶聯(lián)受體的特征。近年來(lái)，Mas受體在腦、血管、腎臟、心臟等器官的活性已經(jīng)被證實(shí)［7］。

本研究檢測(cè)到Mas及ACE2在大鼠胰腺內(nèi)、外分泌腺均有表達(dá)，提示胰腺存在局部的RAS。胰腺局部RAS與胰島功能之間存在著密切聯(lián)系，Mas敲除的FVB/N小鼠出現(xiàn)血脂異常、胰島素水平升高，約有50%出現(xiàn)腹部脂肪塊增多［8］。Mas缺失小鼠出現(xiàn)葡萄糖耐量異常和胰島素敏感性下降，提示Mas受體在胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展中的作用。

OLETF大鼠為自發(fā)性糖尿病大鼠，利用該品系動(dòng)物探討人類(lèi)2型糖尿病的病因與發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究中OLETF大鼠具有肥胖、高血糖、高血脂及高胰島素水平等特征，這與以往研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)OLETF大鼠胰島細(xì)胞的Mas在mRNA及蛋白水平均顯著降低，而ACE2在mRNA及蛋白水平雖然僅呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示在糖尿病大鼠胰島細(xì)胞Mas的改變先于ACE2變化。

2型糖尿病發(fā)生中RAS作用的確切機(jī)制尚不清楚。值得一提的是，最近關(guān)于胰島局部RAS的存在，和其對(duì)胰島功能的作用為應(yīng)用RAS阻斷劑減少2型糖尿病發(fā)生的相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)提供了一種新的解釋。近年有報(bào)道應(yīng)用Mas受體阻斷劑可觀(guān)察到第一時(shí)相胰島素分泌缺失，Mas缺失小鼠呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、NO產(chǎn)生減少［9］。相關(guān)報(bào)道還證實(shí)Ang-(1-7)通過(guò)Mas發(fā)揮保護(hù)心臟的作用，雖然相關(guān)的信號(hào)通路尚不明確，但慢性Mas缺失將導(dǎo)致心肌細(xì)胞 Ca2+流峰值下降［10］。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Mas及ACE2在大鼠胰腺的內(nèi)外分泌腺均有表達(dá)，提示胰腺內(nèi)分泌腺存在內(nèi)在的RAS。糖尿病大鼠的胰島細(xì)胞Mas基因及蛋白水平的改變?yōu)榧由盍艘认賰?nèi)分泌腺的RAS與糖尿病關(guān)系的理解提供了一定依據(jù)。

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