胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)影響的觀察△

胡雅瓊　林渺滿　林　凡（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院　福州　350122）

胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)影響的觀察△

胡雅瓊林渺滿林凡（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院福州350122）

目的：觀察胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)的影響。方法：人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1采用相同的培養(yǎng)條件處理后，隨機(jī)分為無胎牛血清組和胎牛血清組，分別采用無胎牛血清培養(yǎng)基和含胎牛血清培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）接種于成血管基質(zhì)膠，培養(yǎng)6h后用倒置相差顯微鏡觀察不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞血管管腔形成情況。結(jié)果：無胎牛血清組的血管管腔數(shù)明顯多于胎牛血清組（P＜0.05）。結(jié)論：提示在體外成血管實(shí)驗(yàn)中無胎牛血清的條件有利于內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。

HMEC-1細(xì)胞 胎牛血清 體外成血管

血管新生是機(jī)體從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展形成新血管的過程，對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，以及冠心病等缺血性疾病治療有著重要意義。隨著這些疾病日益危害人類的健康，血管新生研究領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注，有關(guān)血管新生的實(shí)驗(yàn)方法不斷發(fā)展。血管新生的過程涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、芽生、分裂和分支以及新的毛細(xì)血管網(wǎng)的形成。因此，毛細(xì)血管網(wǎng)的形成是內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的最終體現(xiàn)。自從國(guó)外的研究者們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下具有形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于血管新生研究［1～3］。但對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)條件的研究還有一些盲點(diǎn)。胎牛血清是細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的重要培養(yǎng)基添加劑，為細(xì)胞體外生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種因子等。胎牛血清的添加是否影響內(nèi)皮細(xì)胞的體外成血管能力？我們針對(duì)上述問題進(jìn)行了研究，以期優(yōu)化內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)研究的開展。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑：人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基（由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)），表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF，購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司），氫化可的松（購(gòu)自BioBasic公司），碳酸氫鈉（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司），0.25%胰蛋白酶（購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司），體外成血管試劑盒（In Vitro Angiogenesis Assay Kit，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：HMEC-1細(xì)胞采用MCDB-131培養(yǎng)液（含10ng/ mL EGF、1μg/mL氫化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收集，制成單細(xì)胞懸浮液后，以20×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板。細(xì)胞經(jīng)24h同步化后以含5%FBS MCDB-131培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。

1.2.2鋪設(shè)基質(zhì)膠：根據(jù)In Vitro Angiogenesis Assay Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，將基質(zhì)膠稀釋液與基質(zhì)膠按1∶9的比例混勻后，置于冰上按50μL/孔加入預(yù)冷的96孔板中，鋪平膠面后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。

1.2.3細(xì)胞分組及體外成血管：將貼壁培養(yǎng)的HMEC-1細(xì)胞采用0.25%胰蛋白酶消化收集后，制成單細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為胎牛血清組（5%FBS）和空白胎牛血清組（0%FBS）。然后將各組細(xì)胞懸液稀釋至16×104個(gè)/mL的密度，按毎孔150μL重新接種于鋪有成血管基質(zhì)膠的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，觀察細(xì)胞出芽相互連接形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，在200倍相差倒置顯微鏡下取6個(gè)視野拍照（倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)，德國(guó)Leica公司），計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在體外成血管實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠上生長(zhǎng)一段時(shí)間后出芽形成管腔。形成的管腔數(shù)可反映細(xì)胞的體外成血管能力。圖1顯示，空白胎牛血清組的血管管腔數(shù)明顯多于胎牛血清組（P＜0.05），而且管腔更大，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，提示在體外成血管實(shí)驗(yàn)中無胎牛血清的條件有利于內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。

3討論

內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行гu(píng)價(jià)某種特定因素對(duì)血管生成的影響，是體外血管新生研究的常用方法。一些實(shí)驗(yàn)研究表明，影響內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管的因素眾多。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)體外成血管有較大影響。胎牛血清含有細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分和一些生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞體外培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用，亦可能是內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)的重要影響因子。本研究通過觀察胎牛血清對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）體外成血管實(shí)驗(yàn)的影響，發(fā)現(xiàn)在胎牛血清存在或不存在的條件下，HMEC-1細(xì)胞均能在基質(zhì)膠上形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)。但是相對(duì)于5%濃度的胎牛血清培養(yǎng)基，采用無胎牛血清的培養(yǎng)基接種細(xì)胞至基質(zhì)膠上形成的血管管腔數(shù)量更多，管腔更大，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，提示不含胎牛血清的培養(yǎng)基有利于HMEC-1細(xì)胞形成血管管腔結(jié)構(gòu)，這與其他研究者結(jié)論類似［4～6］。胎牛血清含有的物質(zhì)大多來自母體，主要成分為多肽、蛋白質(zhì)和激素。其中一些物質(zhì)如促細(xì)胞增殖因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖，胰島素有助于內(nèi)皮細(xì)胞分析，氫化可的松能促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，本研究的體外成血管過程中，胎牛血清的缺失可能抑制了人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的增殖，從而有利于誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移，進(jìn)而更容易形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)［4］。這些結(jié)果為HMEC-1細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化提供了有效依據(jù)，有利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

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B

1672-8351（2016）08-0111-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81102844），福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2016J01389），福建中醫(yī)藥大學(xué)校管項(xiàng)目（X2013021），國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510393003）。