藤黃酸誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的關(guān)系

張洪明，趙新國，陳季北

(江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院呼吸科，江蘇鹽城，224000)

肺癌無論是發(fā)病率還是死亡率均居全球癌癥首位，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80% ～85%。而75%肺癌患者臨床確診時病程已達(dá)Ⅲ～Ⅳ期，所以化療成為目前主要的治療手段。但化療有效率僅為30%～40%，且這個水平已達(dá)到一個平臺。因此尋找新的藥物成為目前肺癌治療的熱點。藤黃(Gamboge)是藤黃科植物藤黃樹(Garcinia hanbaryi Hook.f.)的樹干被割傷后流出的樹脂，藤黃酸(GA)為藤黃的重要活性成分之一，分子式是C38H44O8(圖1)，不僅具有抗病毒、抗炎、抗感染作用，還具有體良好的抗腫瘤活性。

圖1 GA的結(jié)構(gòu)

目前研究發(fā)現(xiàn)，GA的抗腫瘤作用可通過抑制 TOPOⅡα 的催化活性［1］、誘導(dǎo)凋亡［2］、抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性［3］、激活T淋巴細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］、細(xì)胞周期阻滯［5］，抗血管生成活性［6］等途徑來實現(xiàn)。迄今為止，GA抗腫瘤作用的確切機(jī)制還不十分清楚。Kasibhatla等［2］研究發(fā)現(xiàn)，GA的分子靶點為TFR，當(dāng)GA和細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合后，影響TFR的內(nèi)在化，誘導(dǎo)了一個獨特的凋亡信號通路，引起腫瘤細(xì)胞的快速凋亡。本實驗旨在進(jìn)一步研究GA誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用與其細(xì)胞表面TFR表達(dá)水平的關(guān)系，以及促凋亡的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

SPC-A1人肺腺癌細(xì)胞株及SK-MES-1人肺鱗癌細(xì)胞株購買于上海生命科學(xué)研究所。GA由江蘇連云港康緣藥業(yè)股份有限公司提供，GA的125I標(biāo)記及Na125I由江蘇原子醫(yī)學(xué)研究所提供(江蘇無錫)。RPMI-1640、MEM購自美國GIBCO公司。國產(chǎn)胎牛血清購自杭州四季青有限公司。進(jìn)口胎牛血清由美國CLARK公司提供。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體CD71(DF1513)購自美國Santa Cruz公司。SP-9002免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋有限公司。Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自Bio Vision。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SPC-A1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%的國產(chǎn)胎牛血清、青霉素 100 U/mL和鏈霉素 150 μg/mL的PRMI-1 6 4 0培養(yǎng)基中，5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。SK-MES-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%的進(jìn)口胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素150 μg/mL的MEM培養(yǎng)基中，5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 免疫組化法測定細(xì)胞表面TFR的表達(dá)

取對數(shù)生長期的SPC-A1和SK-MES-1細(xì)胞爬片后，丙酮固定，晾干后樹膠固定于載玻片上，PBS沖洗后加3%H2O2室溫10 min，PBS沖洗后加封閉用正常山羊血清工作液室溫15 min，傾去，勿洗。滴加 1∶50稀釋的一抗 CD71(DF1513)(以PBS代替一抗作陰性對照)，37℃，3 h，PBS沖洗后加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫15 min，PBS沖洗后加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，PBS沖洗后加新鮮配制的DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止反應(yīng)。酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。用Image-proplus軟件測定光密度值分析2組細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)水平。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測肺癌細(xì)胞株凋亡率

根據(jù)IC50值分別用0、0.8、1.5、1.6、2.0、3.2 μM的GA處理 SPC－A1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞后 PBS沖洗 2次，加入 Annexin-FITC及10μL的PI，行流式細(xì)胞儀檢查，同一濃度重復(fù)3 次。根據(jù)IC50值分別用0、1.2、1.5、2.0、2.4、4.8 μM的GA處理 SK-MES-1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞后 PBS沖洗 2次，加入 Annexin-FITC及10μL的PI，行流式細(xì)胞儀檢查，同一濃度重復(fù)三次。

1.5 Western blotting檢測 Bax，p53，Caspase2，Caspase 9，Caspase 10蛋白的表達(dá)

用 0.9%生理鹽水及 0.8、1.6、3.2 μM 的 GA作用于SPC-A1細(xì)胞，以及用0.9%生理鹽水和1.2、2.4、4.8 μmol/L 的 GA 作用于 SK-MES-1 細(xì)胞24 h后，胰酶消化后，分別收集2組細(xì)胞，棄上清，加入蛋白質(zhì)裂解液、蛋白酶抑制劑提取總蛋白。按試劑盒說明，測定蛋白濃度后行變性聚丙烯胺凝膠電泳。分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，給予5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶100稀釋的一抗(β-actin為內(nèi)參照)4℃ 過夜，TBST洗膜3次，加入1∶100稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，AP顯色。每組試驗重復(fù)3次。采用sensiansys凝膠圖像分析系統(tǒng)測定條帶的積分吸光度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TFR在SPC-A1和SK-MES-1細(xì)胞

表面的表達(dá)水平(圖2)。

用免疫組化SP染色法測定2組肺癌細(xì)胞表面TFR的表達(dá)水平。根據(jù)光密度值結(jié)果顯示:SPC-A1(A1)組細(xì)胞表面的TFR的表達(dá)強(qiáng)于SKMES-1(B1組)細(xì)胞。

圖2 2組腫瘤細(xì)胞表面TFR受體表達(dá)差異

2.2 GA誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡

不同濃度的 GA引起 SPC-A1(圖3)，SKMES-1(圖4)細(xì)胞的凋亡率不同(凋亡率為每個圖 中Q2+Q4的值)。分別用0、0.8、1.5、1.6、2.0、3.2 μmol/L 的 GA 處理 SPC-A1 24 h 后，凋亡率分別為 1.7%，6.8%，48.2%，61.6%，65.7% ，95% 。分別用0、1.2、1.5、2.0、2.4、4.8 μmol/L 的 GA 處理 Sk-MES-1 24 h 后，凋亡率分別為3.1% ，16.7% ，19.4% ，26% ，83.5%，97.3%。相同濃度(1.5 及 2.0 μmol/L)的GA作用2組細(xì)胞時，SPC-A1細(xì)胞凋亡率均大于SK-MES-1細(xì)胞(圖5)。

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Bax，p53，Caspase2，Caspase 9，Caspase10的上調(diào)

無論是SPC-A1還是SK-MES-1細(xì)胞，隨著干預(yù)GA濃度的加大，Bax，p53，Caspase2，Caspase 9，Caspase 10蛋白表達(dá)逐漸增加(圖 4)。但4.8 μM 的 GA作 用 于 SK-MES-1時 ，與2.4 μmol/L 相比，Bax表達(dá)不再增加。

3 討論

TFR是一種II型跨膜糖蛋白，是由2個同源二聚體(180 kDa)的亞基通過2條二硫鍵交聯(lián)而成。所有的正常細(xì)胞都有低水平的TFR的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的TFR表達(dá)增加［7－8］，這可能是因為腫瘤細(xì)胞對鐵的需求增加。本研究也證實肺腺癌SPC-A1細(xì)胞及肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞表面均有TFR表達(dá)，SPC-A1細(xì)胞表面的TFR的表達(dá)強(qiáng)于SK-MES-1細(xì)胞。

圖3 GA引起SPC-A1細(xì)胞的凋亡率

圖4 GA引起SK-MES-1細(xì)胞的凋亡率

圖5 相同濃度下的GA引起SPC-A1及SK-MES-1細(xì)胞的凋亡率的差異

Kasibhatla S等［2］用GA作用于TFR表達(dá)有明顯差異的4組細(xì)胞5 h發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面TFR表達(dá)(4+)的細(xì)胞的凋亡率接近80%，而細(xì)胞表面TFR表達(dá)(－)的細(xì)胞凋亡率幾乎為0，與本研究結(jié)果一致。作者通過流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)在相同濃度(1.5及2.0 μmol/L)的 GA 作用這 2 組細(xì)胞時，SPC-A1細(xì)胞凋亡率均大于SK-MES-1細(xì)胞(P=0.000)。因此認(rèn)為GA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用與腫瘤細(xì)胞表面的TFR有關(guān)，TFR的表達(dá)水平越高則腫瘤細(xì)胞對GA的敏感性越高。

引起凋亡的通路主要包括內(nèi)、外源性凋亡通路。外源性途徑，即死亡受體途徑，主要是通過死亡受體來完成的，其中最典型的死亡受體包括Fas、DR4/DR5、TNFR1，其 中 DR4/DR5 屬 于TRAIL的受體。目前只有3種TNF家族蛋白分子被報道具有誘導(dǎo)凋亡功能，分別是TRAIL、FasL和 TNF-α。Kasibhatla 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，用 Fas-Fc及TNF-Fc嵌合蛋白干擾死亡受體信號，對GA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有任何影響。而Pandey等［9］研究發(fā)現(xiàn)，GA是通過調(diào)節(jié)NF-kappaB信號通路來加強(qiáng)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。即GA究竟通過何種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡仍說法不一。Caspase按功能分為2類:一類是凋亡起始酶，包括Caspase-1，2，4，5，8，9，10，11，12，13;另一類是凋亡執(zhí)行酶，包括Caspase-3，6，7。在細(xì)胞外凋亡途徑中，當(dāng)死亡配體(如Fas配體或Fas抗體)與細(xì)胞膜上的特異性死亡受體結(jié)合后，形成一個含有受體、FADD和Caspase8或10［10］的復(fù)合物，稱為死亡誘導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體(DISC)。

在復(fù)合物中，Caspase8或10通過自身消化而被激活成具有活性的Caspase四聚體。成熟的Caspase8，10具有蛋白酶活性，直接作用于Caspase3，6，7，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11－16］。細(xì)胞內(nèi)途徑又稱線粒體途徑［12］，當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蜃右鸺?xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿時，與胞漿中的凋亡蛋白激活因子1羧基端的WD重復(fù)序列結(jié)合，形成多聚復(fù)合物，多聚復(fù)合物結(jié)合胞質(zhì)中的Caspase 9前體，形成巨大復(fù)合物，導(dǎo)致Caspase 9前體活化成為 Caspase 9，后者再活化下游的Caspase 3，被活化的Caspase 3再發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Kasibhatla等［2］研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 8參與了GA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但在TFR的免疫沉淀中沒有發(fā)現(xiàn)DISC。本研究結(jié)果顯示:凋亡起始酶Caspase2，9，10也參與了GA誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，且隨著GA濃度的加大，表達(dá)逐漸增加［17－19］。

p53基因位于人的17號染色體短臂1區(qū)3帶1亞帶(17p13.1)，有11個外顯子組成，編碼393個氨基酸組成的53KD的核內(nèi)磷酸化蛋白，它的啟動子包含大量常見轉(zhuǎn)錄因子，如Sp1，NF-kappaB 或 c-Jun 的共有結(jié)合蛋白［20－23］。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，p53反式激活或反式抑制許多下游的不同基因而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。p53介導(dǎo)反式激活的凋亡相關(guān)基因包括凋亡前體蛋白Bcl-2家族成員，包括Bax及Bid等。凋亡蛋白酶激活因子1是凋亡體中的一個重要成分;Fas;CD95，DR4/DR5［24］。本實驗中p53和Bax的表達(dá)均上調(diào)，說明p53和Bax都參與了GA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，且p53、Bax隨著GA濃度的加大表達(dá)逐漸增加。

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