沉淀-柱層析法純化茶多酚及兒茶素含量測定

朱宇惠，張繼

（1.潞安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西長治 046204；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730073）

茶已被人們譽為世界性飲料，茶葉的一些生理活性已被人們逐步開發(fā)利用。它的活性成分茶多酚（Tea Polyphenols，簡稱TP）又稱茶鞣或茶單寧，是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮類、花色素類和酚酸類四種物質(zhì)[1]。兒茶素主要指兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸脂（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）和表沒食子兒茶素沒食子酸脂（EGCG）七種兒茶素[2]。

本實驗利用沉淀法去除茶多酚粗品中咖啡堿等雜質(zhì)，再用柱層析法精制茶多酚。最后采用高效液相和福林酚試劑比色法的聯(lián)用對茶多酚產(chǎn)品進行了定性、定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

無水乙醇、濃鹽酸、氯化鋅、碳酸氫鈉、石油醚、乙酸乙酯、甲酸均為分析純；茶多酚粗品購自天水維康生物工程有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

PHS-3C精密PH計：上海安亭吉路149號雷磁儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：保定市陽光儀器廠；SHD-ⅢN型循環(huán)水式多用真空泵：保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；DF-101S焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；柱層析硅膠（200目～300目）；層析柱（口徑1.5cm）；紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；ES5000-1電子天平：沈陽龍騰電子有限公司。

1.3 方法

金屬沉淀法包括下述沉淀實驗，酸轉(zhuǎn)溶實驗，乙酸乙酯萃取實驗和減壓蒸餾實驗四部。

1.3.1 茶多酚粗品的預(yù)處理

為了使茶多酚最大范圍的溶解，并為下一步的沉淀反應(yīng)提供最佳的沉淀環(huán)境，該試驗選用60%乙醇溶液溶解茶多酚粗品，并配成濃度為100 mg/mL樣品溶液。磁力加熱攪拌器調(diào)至50℃，轉(zhuǎn)速為40 r/min，攪拌樣品溶液[3]。30 min后停止攪拌并過濾，濾液即為茶多酚樣品溶液。

1.3.2 沉淀實驗

向茶多酚預(yù)處理溶液中加入復(fù)合沉淀劑（Zn2+、Al3+），控制反應(yīng)的溫度為45℃，并用1.0 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)pH在5.5～6.6范圍內(nèi)，隨之產(chǎn)生大量黃色泥土狀沉淀。靜置10 min，當(dāng)pH無明顯變化時，取上層清夜2 mL～3 mL，加1滴NaHCO3，若無黃色渾濁現(xiàn)象則表明沉淀完全[4-6]。

1.3.2.1 沉淀劑的選擇

常用沉淀劑：①重金屬堿式鹽，如Pb（OH）Ac、Cu（OH）Ac等，但 Pb，Cu，Ba毒性大，不宜使用；② 氫氧化物，如Ca（OH）2，這類沉淀劑屬于強堿，會氧化茶多酚，而且Ca（OH）2為微溶物，沉淀效果也不好；③金屬鹽離子，如 Ca2+、Zn2+、Al3+、Mg2+、Ba2+和 Fe3+等。三類沉淀劑相比較之下，金屬離子沉淀劑價廉，而且在一定的pH下能夠較好地沉淀，且稀酸可轉(zhuǎn)溶。沉淀劑的選擇結(jié)果見表1。

表1 沉淀劑的選擇Table 1 The selection of the precipitation

如表1所示，鋅離子和鋁離子對茶多酚的沉淀具有協(xié)同作用，茶多酚的沉淀率最高，而且在相對偏酸性的環(huán)境下沉淀，不易使茶多酚氧化。因此復(fù)合沉淀劑比單一沉淀劑的沉淀效果要好。

1.3.2.2 溶液pH的選擇

復(fù)合沉淀劑的最佳沉淀pH是5.5～6.6，如果在更酸的環(huán)境下，沉淀物會變性，呈現(xiàn)黏稠的漿糊狀，根本無法抽濾。因此為保證沉淀效果最佳，加沉淀劑前先將溶液pH調(diào)至5.5，然后將酸度計插入溶液中。不斷少量加復(fù)合沉淀劑，根據(jù)酸度計的示數(shù)，加堿使酸度控制在5.5～6.6范圍內(nèi)。還有，為了提高反應(yīng)效率，復(fù)合沉淀劑按質(zhì)量比 m（AlCl3）∶m（ZnCl2）=1 ∶2 稱量好混勻，用蒸餾水溶解成飽和溶液備用。

1.3.2.3 堿的選擇

在上一步調(diào)節(jié)pH時，需要用堿來調(diào)節(jié)。NaOH溶液適宜濃度為0.1 mol/L～0.5 mol/L，濃度過低會使操作體積過大，濃度過高會因茶多酚的局部氧化嚴(yán)重而降低提取率。通過試驗，本試驗采用濃度為1.0 mol/L的NaHCO3溶液。

1.3.2.4 溫度的選擇

在加入沉淀劑的過程中，由于咖啡堿會與茶多酚產(chǎn)生共沉淀作用，而使茶多酚的提取率降低。相應(yīng)地提高溫度會增大咖啡堿的溶解度，使共沉淀作用減小，但是溫度過高會導(dǎo)致茶多酚的氧化。通過試驗，本試驗采用45℃為最佳沉淀溫度。

1.3.3 酸轉(zhuǎn)溶實驗

由于復(fù)合沉淀劑選擇的是氯鹽，為了減少溶液中離子的種類，在酸轉(zhuǎn)溶時選擇稀鹽酸，而不選硫酸。酸濃度太小會需要大量的溶劑；濃度過大，酸用量雖少，但雜質(zhì)含量會增加，茶多酚的提取率降低。通過試驗，本實驗采用的酸試劑為0.5 mol/L～1.0 mol/L的HCl，結(jié)果見圖1。

圖1 酸的濃度在茶多酚提取中的影響Fig.1 Effect of acid concentration on the extraction of TP

1.3.4 乙酸乙酯萃取試驗

乙酸乙酯萃取試驗結(jié)果見表2。

表2 萃取次數(shù)對茶多酚提取率的影響Table 2 Effect of extraction times on the extraction of TP

如表2所示，當(dāng)萃取次數(shù)大于或等于3次后，茶多酚的提取率變化不大。所以為了節(jié)省工序，沉淀轉(zhuǎn)溶后用乙酸乙酯萃取三次即可，每隔5分鐘萃取一次。萃取時間也不宜過長，因為在酸性條件下，乙酸乙酯易水解[7]。

1.3.5 減壓蒸餾試驗

將乙酸乙酯萃取后的有機相合并，減壓蒸餾濃縮，減壓溫度不宜過高，以55℃為宜，濃縮液真空干燥后冷藏，得樣品Ⅰ。

1.3.6 硅膠柱層析實驗

將200目～300目硅膠用石油醚濕法裝柱，樣品Ⅰ上樣，用事先配好的洗脫劑（本實驗選用的洗脫劑是石油醚、乙酸乙酯和甲酸按不同比例配成極性由小到大的溶液）洗脫，極性逐漸加大，每30毫升接一次溶液，減壓蒸餾，收集樣品Ⅱ。按色帶的不同先后收集了三部分，分別標(biāo)記為 T1、T2，為淺褐色粉末狀；T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10，為白色針狀晶體；T11、T12、T13，為淺黃色晶體[8-9]。

2 分析方法

2.1 福林酚試劑比色法分光光度分析方法

2.1.1 原理

利用福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑氧化茶多酚中的-OH基團會顯藍色的性質(zhì)，用分光光度計測茶多酚的含量。最大吸收波長λmax為765 nm，用沒食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚[10]。

2.1.2 結(jié)果與分析

根據(jù)GBIT 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，稱取茶多酚粗品0.2 g，樣品T11為0.03 g，稀釋一定倍數(shù)后分別裝入容量瓶1號，2號中。

式中：A為吸光值；稀釋因子d分別為100、10；樣品干物質(zhì)含量m=100%；樣品質(zhì)量m1=0.2 g，0.03 g；V=10mL；SLOPEStd為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率1.1159。根據(jù)上面公式繪制表3。

表3 茶多酚粗品和茶多酚精制品的含量Table 3 Effect of extraction times on the extraction of TP

如表3所示，茶多酚粗品和樣品T11中茶多酚的含量。因為茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、花色素類和酚酸類四種物質(zhì)，所以該數(shù)據(jù)是指這四種物質(zhì)的總含量。

2.2 高效液相色譜分析方法[11-18]

2.2.1 儀器與試劑

Dionex分析型高效液相色譜儀（Ultimate 3000）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UPT-II-20T優(yōu)普超純水機：成都超純科技有限公司。

甲醇，乙酸，乙腈（色譜純）：山東禹王試業(yè)有限公司化工分公司；標(biāo)品 GA，C，CAF，EC，EGCG，GCG 和ECG，純度≥99%（阿拉丁公司產(chǎn)品）。

2.2.2 高效液相色譜條件

色譜柱：AT LiCHPOM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。檢測波長：278nm。柱溫：35℃。流速：1.000 mL/min。進樣量：50μL。A流動相的配制：90mL乙腈加5mL乙酸定容于1000mL容量瓶，震蕩搖勻，過有機膜（0.45μm），超聲脫氣；B流動相的配制：400mL乙腈加2.5mL乙酸定容于500mL容量瓶，震蕩搖勻，過有機膜（0.45μm），超聲脫氣。梯度洗脫條件：0min～10min，100.0%A；10min～25 min，100.0%～68.0%A，0.0%～32.0%B；25 min～30 min，68.0%A，32.0%B；30 min～35 min，68.0%～100.0%A，32.0%～0.0%B；35min～40min，100.0%A，0.0%B。

表4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Table 4 Standard working curve

2.2.3 高效液相色譜分析方法

2.2.3.1 穩(wěn)定溶液的配制方法

將50 mL乙腈加入500 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過有機膜（0.45 μm），超聲脫氣。

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

根據(jù)GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，將標(biāo)品稀釋不同濃度后，分別測出相應(yīng)濃度下各標(biāo)品的保留時間（RT）和積峰面積，作出標(biāo)品積峰面積（mAU）—濃度（μg/mL）曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品各成分含量，結(jié)果見表4。如圖2所示，原料茶多酚粗品中GA、C、CAF、EC的含量較少，所以這四條工作曲線的線性范圍從0 μg/mL開始。

2.2.3.3 定性分析

將茶多酚粗品和試驗制得的13個樣品（T1～T13）用穩(wěn)定溶液稀釋一定倍數(shù)后，在2.2.2的色譜條件下，所得的高效液相圖譜，通過與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的比較，確定出樣品中各生理活性成分峰，結(jié)果見圖3。

2.2.3.4 定量分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表4所示，計算樣品中各成分的濃度X（μg/mL），再代入如下公式計算出樣品中各成分的含量，結(jié)果如表5所示。

式中：M為樣品中各成分的含量，%；V為樣品定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，μg；d為稀釋倍數(shù)。

2.2.4 結(jié)果與分析

如表5所示，通過計算得到了樣品中各主要成分的百分含量；T1和T2除了含沒食子酸、咖啡堿較多外，HPLC譜圖中還存在很多雜質(zhì)峰；T3～T10的HPLC譜中只有 GA 峰（RT≈5.45）和 CAF峰（RT≈18.990），且可看到?jīng)]食子酸的含量逐漸減少，而咖啡堿的含量逐漸增加后又逐漸減少；T11～T13的沒食子酸含量保持在3.00%左右，咖啡堿含量保持在2.00%左右。

3 結(jié)論

圖2 茶多酚粗品HPLC圖譜Fig.2 HPLC of tea polyphenol

圖3 混標(biāo)溶液HPLC圖譜Fig.3 HPLC of standard specimen

表5 樣品中各成分含量Table 5 Contents of components in samples%

本試驗結(jié)合金屬離子沉淀法和硅膠柱層析法的優(yōu)點，嘗試了沉淀-柱層析試驗。通過福林酚試劑比色法和高效液相色譜法，由分析數(shù)據(jù)可知，先用沉淀法去除茶多酚粗品中的咖啡堿，再用硅膠柱層析法精制茶多酚的方法是可行的。

該方法提取茶多酚的最佳工藝條件為：溫度50℃下用60%乙醇水溶液溶解茶多酚粗品，轉(zhuǎn)速40 r/min，復(fù)合沉淀劑 m（AlCl3）∶m（ZnCl2）=1 ∶2，沉淀條件為1.0 mol/LNaHCO3調(diào)節(jié) pH=5.5～6.0，0.5～1.0 mol/LHCl轉(zhuǎn)溶沉淀，乙酸乙酯萃取三次，減壓蒸餾溫度為55℃，柱層析法的洗脫劑選擇石油醚，乙酸乙酯和甲酸按比例配制的溶液。

比較表3和表5，酮類、花色素類和酚酸類這三種物質(zhì)在茶多酚粗品和樣品T11中的含量分別為3.89%、0.4%。說明沉淀-柱層析法還可以有效地除去粗品中的黃酮類、花色素類和酚酸類物質(zhì)。如表5所示，T11～T13中C和EC的含量較少，EGCG的含量最多；兒茶素的總量從粗品的20.34%到T11的80.70%，雜質(zhì)明顯減少，含量也有顯著增高。進一步印證了沉淀-柱層析法精制茶多酚的方法是可行的。遺憾的是樣品中沒食子酸和咖啡堿從始至終都存在，而且由于兒茶素各單體在有機溶劑中的極性相近，硅膠柱層析法無法將其很好的分開。

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