動物源食品中聚醚類多殘留液質聯(lián)用檢測技術研究

張駿，王碩，鄭文杰，許泓，林安清

（1.天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461）

近30年來，獸藥（包括藥物添加劑）在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應用日益廣泛，其在降低發(fā)病率與死亡率、促生長、提高飼料利用率和改善產(chǎn)品品質方面的作用是十分顯著的。獸藥殘留除了由于防治疾病用藥引起外，將獸藥作為飼料添加劑使用是主要原因，而聚醚類藥物就是其中代表性的一類獸藥。聚醚類抗生素（polyether antibiotics，PEs）是從金色鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物分離得到的一類離子載體抗生素，對多種球蟲有抑制作用，并能提高飼料轉化率，促進家畜生長，在家畜生產(chǎn)中廣泛應用。在化學結構上，此類藥物分子中通常含有若干環(huán)狀醚鍵，分子一端有一羧基（表1），分子兩端借助氫鍵相連而生成環(huán)狀結構后，容易與Na+、K+等離子結合生成親脂性絡合物，增加離子向球蟲細胞內運輸，為了平衡滲透壓，大量水分進入球蟲細胞內，導致球蟲腫脹而死亡，因此也被稱為離子載體類抗球蟲藥。此類藥物對雞多種艾美耳球蟲有特效，對球蟲子孢子，第一代、第二代裂殖子均有抑殺作用，并能促進動物生長發(fā)育，增加體重和提高飼料利用率，故亦可用作促生長劑[1－3]。離子載體類藥物對動管系統(tǒng)有明顯的影響，具有擴張冠狀血管和增加心臟冠脈流量的作用。飼養(yǎng)過程中，PEs抗球蟲藥物的添加量過高導致雞肉或雞蛋中的藥物殘留，可能對人類身體健康產(chǎn)生危害，尤其可能會加劇心血管患者的病情，因此安全范圍較窄。不合理給藥或飼料污染會導致動物中毒、動物性食品中藥物殘留及抗藥性問題。目前，歐盟不允許PEs作為飼料添加劑使用，我國規(guī)定雞肉中PEs的最高殘留限量（MRLs）為：鹽霉素（salinomycin，SAL）600 μg/kg；甲基鹽霉素（narasin，NAR）600 μg/kg；莫能菌素（monensin，MON）1500 μg/kg；馬杜霉素（maduramicin，MAD ）240 μg/kg； 拉 沙 里 菌 素（lasalocid，LAS）400 μg/kg（雞肝）。因此，研究建立動物源性食品中聚醚類藥物多殘留檢測方法，對于有效監(jiān)控該類藥物的合理使用、保障我國動物源性食品安全具有重要的意義。

表1 5種目標物化學信息一覽表Table 1 Chemical information of 5 PEs

目前聚醚類（PEs）殘留的檢測方法有微生物法、免疫學法[1]、高效液相色譜法（HPLC）[2-4]、液相色譜-質譜法（LC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）[5]等。微生物法和免疫學法適用于藥物的快速篩選，但無法準確地對其定性定量，且存在假陽性現(xiàn)象。HPLC法多采用柱前衍生化[2-3]或柱后衍生化[4]，操作相對繁瑣，且未檢索到可同時分析鹽霉素、甲基鹽霉素、莫能菌素、馬杜霉素、拉沙洛菌素的方法。LC-MS法、LCMS/MS法不需衍生化，樣品處理簡單快速，可同時檢測上述5種藥物，而且后者還能獲得更高的靈敏度和更佳的定性效果。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

1.1.1 儀器

Agilent 1100-API 4000液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀：Agilent公司-AB公司，美國，配有電噴霧電離源和大氣壓化學電離源，并具有正-負電離方式自動切換功能；ASPEC XLi自動固相萃取儀：Gilson公司，美國；500 mg硅膠固相萃取柱：J.T.Baker公司，美國，使用前用6 mL正己烷分2次預洗；T25高速均質器：轉速大于10 000 r/min：IKA公司，德國；N-EVAP112氮氣吹干儀：OA公司，美國；231渦旋振蕩器：Fisher Scientific公司，美國；離心機：北京醫(yī)療器械廠，中國，轉速大于3 000 r/min。

1.1.2 試劑和材料

甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、甲酸均為色譜純：0.1%甲酸水溶液：取1 mL甲酸溶解于1 000 mL水中；淋洗液：二氯甲烷-正己烷（50∶50，體積比）；洗脫液：二氯甲烷-甲醇（80∶20，體積比）；聚醚類標準品：鹽霉素，純度≥99%；甲基鹽霉素，純度≥97%；馬杜拉霉素，純度≥97%；莫能菌素，純度≥97%；拉沙里菌素，純度≥97%；聚醚類標準溶液：分別準確稱取適量的鹽霉素、甲基鹽霉素、馬杜拉霉素、莫能菌素、拉沙里菌素，用甲醇配制成1 mg/mL標準貯備溶液，保存于-18℃冰柜中，可使用一年，再根據(jù)需要以甲醇配制成不同濃度的混合標準溶液作為標準工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用三個月；基質提取液：空白樣品，操作同1.2.1處理后得到的溶液；基質標準工作溶液：將標準工作溶液混合后在氮吹儀中吹干，以基質提取液溶解，渦旋30 s后即為基質標準工作溶液。

1.1.3 樣品

雞肉、豬肉、魚肉：均購自本地超市。

1.2 方法

1.2.1 提取和凈化

取有代表性樣品，絞碎后攪拌均勻，制成實驗室樣品。試樣分為二份，置于樣品盒中，密封，并做上標記。稱取絞碎混勻后測試樣品約5.0 g（精確到0.1 g）于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，渦動2 min，離心（3 000 r/min）5 min，取上清液于50 mL雞心瓶中；剩余殘渣用15 mL乙腈重復提取1次；合并上清液。于40℃下旋轉蒸發(fā)至干，用3 mL正己烷洗滌雞心瓶，渦動30 s，轉入10 mL離心管中，再用2 mL正己烷洗滌雞心瓶，轉入相同離心管中。

用6mL正己烷預洗硅膠柱，并使正己烷不流干。將收集的上清液過柱，用15mL二氯甲烷∶正己烷（50∶50，體積比）淋洗，再用 10 mL二氯甲烷 ∶甲醇（80∶20，體積比）洗脫，收集洗脫液，并于40℃下用氮氣吹干，然后用1 mL乙腈復溶，過0.22 μm有機濾膜，濾液供LC/MS/MS分析。

1.2.2 測定條件

1.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Sunfire C18柱，100 mm × 2.1 mm，3 μm（Waters公司，美國）；柱溫：25℃；流動相：乙腈-0.1%甲酸水（90∶10，體積比）；進樣量：25 μL；流速：0.4 mL/min。

1.2.2.2 質譜條件

離子化方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；霧化氣壓力：12 psi；氣簾氣壓力：10 psi；輔助氣1 壓力：30 psi；輔助氣 2 壓力：30 psi；電噴霧電壓：5 000 V；監(jiān)測離子對、去簇電壓、入口電壓、碰撞能量和碰撞室出口電壓見表2。

表2 聚醚類目標物質譜檢測參數(shù)一覽表Table 2 MS/MS parameters of PEs

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

聚醚類抗生素分子中含有多個環(huán)狀醚鍵，結構特征是在直鏈碳骨架上連成多個四氫呋喃、四氫吡喃等含氧雜環(huán)；分子一端有1個羧基；在結晶狀態(tài)，分子兩端可借助氫鍵相連而成環(huán)狀構型，具有離子載體性質，可形成多種金屬鹽，常以鈉鹽、鉀鹽或銨鹽形式存在。微溶或不溶于水，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等。在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定，其游離酸穩(wěn)定性較差。根據(jù)以上特點，為了同時提取出動物組織樣品中的這些化合物，采用了極性有機溶劑提取的方法。選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷為提取劑，對比提取效果。采用甲醇提取的極性雜質較多，尤其是提取蛋白含量較高的液體樣品時，需要用酸沉淀其中的蛋白質，而聚醚類抗生素在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較差，回收率較低。用乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷提取時，提取液中脂溶性共提物較多，為下一步凈化帶來困難。乙腈既可以避免共提出太多的脂溶性雜質，又能得到滿意的回收率，實驗結果表明，5種聚醚類藥物回收率均可＞75%。本實驗選擇乙腈為提取劑。

對振蕩或超聲的提取方法均進行研究，結果表明，超聲或振蕩對回收率沒有明顯的影響。因此最后采用乙腈渦動2 min提取5種聚醚類藥物，回收率均達到要求，穩(wěn)定性好，基質對測定無干擾，且操作過程簡單快速。

2.1.2 凈化條件優(yōu)化

本研究采用固相萃取柱凈化，比較了硅膠柱、C18柱、Oasis HLB柱的凈化效果。由于目標化合物性質差異較大，使用HLB、C18等固相萃取柱，難以同時進行提取和凈化并獲得較好的回收。進一步的對比實驗結果表明采用硅膠柱進行凈化處理，可獲得全部被測物較滿意的回收，凈化效果和平行性較理想。因此選用硅膠柱作為樣品凈化柱。又比較了國內外不同廠家牌號的硅膠柱，結果表明美國J.T.Baker公司Bakerbond SPE Sillica Gel（SiOH）Column（500 mg）回收率相對較高且重現(xiàn)性好，因而最終選擇用Bakerbond SPE硅膠柱作為本研究的凈化柱。

本研究按有關文獻報道的硅膠柱固相萃取方法進行研究時，5種藥物在添加水平不大于50 μg/kg時萃取回收率大于90%，添加0.1倍的MRL（雞肉）時萃取回收率大于65%，添加1倍的MRL（雞肉）時LAS、MON和MAD的萃取回收率均大于75%，但SAL和NAR低于20%，該結果表明大部分SAL和NAR發(fā)生了柱保留。因此，我們先嘗試使用4 mL甲醇洗脫，將藥物全部洗脫下來，但由于甲醇洗脫能力很強，在獲得高回收率的同時也帶來了嚴重的雜質干擾，對質譜儀的污染很大。參考一些文獻，本研究以正己烷為上樣液，對不同比例的二氯甲烷∶正己烷（體積比分別為60 ∶40、50 ∶50、40 ∶60）作為淋洗液進行了研究，確定了二者體積比為50∶50時，洗滌效果好且回收率高。二氯甲烷∶甲醇（80∶20，體積比）作為洗脫液其溶劑強度比甲醇低，能減少極性雜質的共洗脫，而目標藥物的洗脫效果好。因此，最終我們采用正己烷為上樣液，二氯甲烷∶正己烷（50∶50，體積比）洗滌，二氯甲烷∶甲醇（80∶20，體積比）洗脫，保證回收率的同時達到去除雜質的作用，使空白無干擾，并減少了有機溶劑的用量，縮短了樣品的處理時間。

2.2 液相條件優(yōu)化

本研究比較了ZORBAX Eclipse SB－C8柱，150 mm×4.6 mm，3.5 mm（Agilent公司，美國）；和 Sunfire C18柱，100 mm ×2.1 mm，3 mm（Waters公司，美國）兩種液相分析柱對聚醚類藥物的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)，Sunfire C18柱，100 mm × 2.1 mm，3 mm（i.d.）分析柱對目標化合物的靈敏度和分離度都較理想，因此選擇該柱為分析柱。

本研究采用電噴霧的電離模式，由于電噴霧是在溶液狀態(tài)下電離，因此，流動相的組成對目標化合物的電離有很大的影響。本研究考察對比了甲醇+水、乙腈+水、甲醇+甲酸水溶液、乙腈+甲酸水溶液、甲醇+乙酸銨水溶液、乙腈+乙酸銨水溶液做流動相的色譜效果。結果表明，乙腈+0.1%甲酸水溶液（0.1%的甲酸提高離子化效率）作為流動相洗脫時，聚醚類藥物分離度和靈敏度較高。

2.3 質譜條件的選擇

用10 μg/mL的5種聚醚類藥物的混合標準溶液，在ESI+模式下進行母離子全掃描，未出現(xiàn)m/z為 [M+1]+的分子離子峰，卻發(fā)現(xiàn)在 [M+23]+處的離子峰很強。這與此類藥物的化學結構和性質有關：聚醚類藥物分子為含有若干雜環(huán)醚基的開鏈結構，通過分子中羧基和羥基間的氫鍵作用形成環(huán)狀結構后，很容易“捕獲”Na+，形成[M+Na]+離子。優(yōu)化準分子離子（[M+23]+）的毛細管電壓、錐孔電壓等質譜參數(shù)后，分別以5種藥物的[M+23]+離子為母離子，對子離子進行全掃描，選擇信號強度較大、干擾較小的兩個碎片離子為特征離子，最后以多反應監(jiān)測（MRM）正離子模式優(yōu)化了各種質譜分析參數(shù)，具體質譜參考條件見表2。

2.4 方法的線性范圍

配制5種聚醚類藥物的系列標準溶液，其濃度分別為 5.0、25、50、100、500 ng/mL 的混合標準溶液，以本方法的測試條件，進樣25 μL進行測定，用峰面積對標準溶液中各被測組分的濃度做圖，其各目標物在檢測范圍內均呈線性關系，線性方程和相關系數(shù)見表3。

2.5 靈敏度

取20個空白樣品進行前處理，LC－MS/MS檢測。按信噪比（S/N）=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ），樣品中5種聚醚類藥物的檢出限為鹽霉素

表3 5種聚醚類藥物線性方程和相關系數(shù)Table 3 Linear equations and related coefficient of 5 PEs

0.002 mg/kg，其余4種為0.005 mg/kg，定量限鹽霉素為

0.005 mg/kg，其余4種為0.01 mg/kg。

2.6 方法的回收率

本研究以不含被測藥物的空白樣品為基質，作了3個水平添加回收率實驗，加標雞肉樣品的色譜圖見圖1，回收率實驗結果見表4。所測5種藥物的室間平均回收率在89.6%～99.2%之間。

2.7 方法的精密度

采用空白基質中添加標準法進行重復性測定，每個水平為10個樣品，精密度（RSD）在5.0%～10.3%之間，結果見表4。

圖1 濃度為0.05 mg/kg雞肉樣品添加回收的質量色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of blank chicken muscle spiked with 0.05 mg/kg PEs

表4 雞肉中聚醚藥物添加回收率和精密度數(shù)據(jù)（測定次數(shù)：10次）Table 4 Average recoveries，relative standard deviations（RSD）of determinations of 5 PEs spiked at 3 levels in chicken muscle（n=10）

2.8 方法的適用性

在本方法研究實驗過程中，先后檢測過動物源食品有：雞肉、豬肉、魚肉等。用不含本方法所測5種聚醚類藥物的上述動物源性樣品分別做添加回收率和精密度試驗，樣品添加不同濃度標準后，按本方法進行樣品制備、凈化和測定，平均回收率為83.8%～99.2%，相對標準偏差CV在3.8%～10.3%之間，表明本方法回收率高，精密度好。

3 結論

本實驗建立了可同時檢測動物源食品中鹽霉素、甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素和拉沙里菌素多殘留的LC－MS/MS方法。在已有的研究基礎上對樣品的前處理方法進行了優(yōu)化和改進。該方法簡單快速，回收率高，重現(xiàn)性好，適用于動物源性食品中聚醚類藥物的多殘留檢測，方法檢出限滿足歐盟指令及我國殘留監(jiān)控要求。

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