蘋果樹枝和葉中根皮苷及根皮素含量變化研究

趙艷敏，王皎，宋光明，宋新波，劉岱琳，*，謝文利

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院，天津 300162）

以往對于蘋果樹枝和葉中根皮苷和根皮素含量的報道都是靜態(tài)資料而對其動態(tài)研究尚較缺乏。本實驗主要探討了一年中生長旺盛期富士蘋果果樹樹枝和葉中根皮素和根皮苷含量動態(tài)變化，以期為蘋果枝和葉的綜合利用開發(fā)提供參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

蘋果樹枝和葉，采自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司蘋果試驗田。供試樣品為三年生富士蘋果果樹，采用隨機(jī)取樣的方選取并確定了生長質(zhì)地充實且無蟲害蘋果果樹三株作為試驗原料提供植株。自2011年5月初開始采樣分析，以后每隔30天進(jìn)行一次，在樹冠4個方向均勻采取4條發(fā)育枝，該樹枝及其樹枝上的葉即為供試樣品。

根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和根皮素標(biāo)準(zhǔn)品（含量均為98%）：購自天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；分析甲醇、色譜甲醇、乙腈（色譜級）、冰醋酸（分析級）、哇哈哈純凈水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC－20AT型高效液相色譜儀（自配SPD－M20A型紫外檢測器、CTO－20柱溫箱）：日本島津公司；FA1204B型電子天平；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：購自上海愛朗公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品20.88 mg和根皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.80 mg，用甲醇定溶于，20 mL的棕色容量瓶中，充分搖勻，得到根皮苷、根皮素質(zhì)量濃度分別為1.044mg/mL和0.140 mg/mL的混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色譜分析條件

色譜柱為phenomenexLuna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 30℃，檢測波長 280 nm，流動相A：冰醋酸∶水=1∶99；B相：乙腈∶水∶冰醋酸=70∶29.8∶0.2，梯度洗脫程序：0～20 min B由0%升到15%，20 min～60 min B 由 15%升到 25%，60 min～85 min B由25%升到60%，85 min～90 min B由60%降至0%；進(jìn)樣體積 20 μL。

1.2.3 樣品處理

將所摘取的新鮮蘋果樹枝、葉分別剪切成約0.5 cm厚度的小塊和1 cm2大小的片狀。分別稱取50 g供試品原料，放入1 000 mL圓底燒瓶中，加入甲醇500 mL，于90℃回流提取30 min，用布氏漏斗過濾后即得粗提液，減壓濃縮至干。精密稱取25 mg干燥粉末至10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.25、2.5、5、7.5mL置于 10mL容量瓶中甲醇定容至刻度，搖勻，取新配置的四種標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液各20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X/（mg/mL）為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y/mV為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，得標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程見表1。

表1 混標(biāo)的回歸方程及線性范圍Table 1 Linear equation and linear rang of mixture standard

2.2 精密度實驗

精密吸取混合對照品溶液（根皮苷1.044 mg/mL，根皮素0.14 mg/mL）20 μL重復(fù)進(jìn)樣5次，測定各標(biāo)準(zhǔn)峰面積，計算RSD值，結(jié)果：根皮苷0.77%、根皮素0.70%。試驗結(jié)果表明，在該條件下精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取同一批供試品原料，按1.2.3項下制備測試樣品，按照 2.1 項下方法分別在 0、2、4、6、8、12 h 測定樣品中根皮苷和根皮素的含量。測得根皮苷和根皮素的峰面積，計算RSD值，結(jié)果顯示根皮苷的RSD為1.39%、根皮素的RSD值為0.81%。說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性很好。

2.4 重復(fù)性實驗

精密稱取同一月份蘋果葉樣品粉末5份，按1.2.3項下制備方法制得待測溶液，依照2.1項下樣品測定方法測定根皮苷和根皮素的峰面積，計算RSD值。根皮苷RSD值為1.85%，根皮素的RSD值為1.99%。試驗結(jié)果表明根皮苷和根皮素的含量測定結(jié)果重現(xiàn)性較好。

2.5 加樣回收率實驗

分別精密稱取5 mg的八月份樹葉9份于5 mL容量瓶中，取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加1、2、3 mL于每三份樣品中，定容至5 mL，按樣品的測定方法處理及測定。根皮苷的加標(biāo)回收率在104.4%～109.1%之間，平均回收率為106.88%，RSD為1.80%。根皮素的加標(biāo)回收率在102.1%～109.6%之間，平均回收率為106.05%，RSD為2.64%。因此，該色譜分析方法適合于蘋果樹枝和葉中根皮苷和根皮素的分析測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.6 樣品分析

2.6.1 色譜分離效果

標(biāo)準(zhǔn)品根皮苷和根皮素的液相色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品根皮苷和根皮素的液相色譜圖Fig.1 HPLC of Phlordzin and Phloretin

按照上述色譜條件，將不同月份的樹枝、樹葉各樣品進(jìn)樣20 μL進(jìn)行液相色譜分析，所得樣品色譜圖見圖2。

圖2 蘋果樹枝和樹葉的液相色譜圖Fig.2 HPLC of apple branches and leave

與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖1比較，可確定峰1為根皮苷峰2為根皮素，峰1和2與前后相鄰兩峰之間的分離度均大于1.5，說明該梯度洗脫方法可以成功的分離根皮苷、根皮素和其他組分。

2.6.2 矮化密植蘋果樹葉中根皮苷、根皮素的含量變化根據(jù)上述色譜條件測定三年生蘋果樹葉5月～11月份根皮苷和根皮素的含量（表2）。

表2 蘋果樹葉中不同月份根皮苷和根皮素含量變化Table 2 Change of phlordzin and phloretin content in apple tree leave at different months

表2結(jié)果顯示，在5月～10月期間隨著葉子的生長發(fā)育根皮苷含量大體成增長趨勢，隨著葉子的不斷老化，11月份根皮苷含量又呈現(xiàn)了明顯的下降趨勢，5月～11月份根皮苷的平均含量為16.31 mg/g。根皮素在5月含量為最高值2.541 mg/g，6月～8月含量不斷降低，降幅達(dá)0.900 mg/g，繼9月含量的小幅上漲后，10月～11月又有明顯的下降直至最低點(diǎn)0.450 mg/g。

2.6.3 矮化密植蘋果樹枝中根皮苷的含量變化

根據(jù)上述色譜條件測定三年生蘋果樹枝5月～11月份根皮苷的含量（表3）。

表3 蘋果樹枝中不同月份根皮苷含量變化Table 3 Change of phlordzin content in apple tree branches at different months

表3結(jié)果表明，蘋果樹枝中的根皮苷含量在5月～11月波動較大，平均含量為11.93 mg/g。在5月～7月隨著枝的發(fā)育呈現(xiàn)小幅的增長，而后出現(xiàn)了明顯的下降至九月的最低含量8.32 mg/g，10月～11月的含量又有了大幅增長，其增幅高達(dá)2.8 mg/g。但在蘋果樹枝中未檢出根皮素。

3 結(jié)論

本文研究表明，在一年中的生長旺盛期的蘋果樹枝和葉中均含有大量的根皮苷，其中樹葉中根皮苷的平均含量為16.31 mg/g，樹枝中根皮苷的平均含量為11.93mg/g，樹葉中的根皮苷含量明顯高于樹枝。另外，僅在樹葉中檢出含有較多的根皮素，平均含量為1.38mg/g，而樹枝中未檢出根皮素。

4 討論

1）有學(xué)說認(rèn)為根皮苷是營養(yǎng)物質(zhì)的一種儲藏形式，而枝的韌皮部是根皮苷產(chǎn)生或存在的主要部位[12]。本文關(guān)于蘋果樹枝中根皮苷的含量變化規(guī)律測定結(jié)果進(jìn)一步印證了這一學(xué)說。在5月份～7月份隨著各器官的生長發(fā)育，根皮苷含量呈增長趨勢；8月份～9月份各器官對能量的需求呈現(xiàn)入不敷出的狀況，此時需要對以儲藏形式存在的根皮苷進(jìn)行酶解提供能量，使得根皮苷含量下降；10月份～11月份各器官發(fā)育停滯或衰敗，使得根皮苷又得以儲藏含量有所上升。

2）本實驗中測得的樹枝、樹葉中根皮苷的含量變化規(guī)律與劉和等[9]的研究報道有較多不同，其原因可能是由于蘋果樹的種類、種植方式、生長年限、氣候和土壤等差異造成的。

3）本研究對蘋果樹葉、枝中根皮苷和根皮素含量的動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行分析，這為蘋果樹枝、葉的開發(fā)利用提供了有利參考。另外，對蘋果樹的栽培和修剪有重大意義。

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