蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中根皮苷主要降解成分分析

李春陽 曲新生 李書芳

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根皮苷是一種存在于植物組織中的物質(zhì)，在蘋果樹組織中含量很高，被認作是蘋果樹貯存碳水化合物的一種形式。蘋果樹腐爛病是一種蘋果樹皮干腐爛病，通常是由于感染蘋果黑腐皮殼菌所引起的，蘋果樹腐爛病可以侵染蘋果樹的多個部位，嚴重影響了蘋果樹的健康，從而造成經(jīng)濟上的損失。雖然國內(nèi)外已經(jīng)有很多人研究了蘋果樹腐爛病菌，但還未有人準(zhǔn)確表明到底是何種物質(zhì)使得蘋果樹中根皮苷發(fā)生降解。因此，現(xiàn)以蘋果樹腐爛病的病原菌及發(fā)酵液中的多種物質(zhì)作為研究對象，對根皮苷的降解進行試驗研究，進而分析出影響根皮苷降解的物質(zhì)，從而揭示出腐爛病的發(fā)病機理，為蘋果樹的種植管理提供理論依據(jù)。

2 試驗方法

2.1 以根皮苷為碳源培養(yǎng)的病原菌發(fā)酵液及其對根皮苷的降解作用 將根皮苷作為培養(yǎng)病原菌的碳源，并保持培養(yǎng)基中的根皮苷濃度為1 g/L。在培養(yǎng)基中加入幾塊蘋果樹腐爛病菌菌餅，室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中保持靜置，每天定時進行振搖。培養(yǎng)10 d左右，用布氏漏斗進行抽濾，得到病菌菌絲，在烘箱中80 ℃烘干并稱取質(zhì)量。取另一份發(fā)酵液，用濾膜過濾，將得到的無菌發(fā)酵液稀釋10倍，檢測根皮苷含量，試驗過程中將不接菌培養(yǎng)作為對照物[1]。

2.2 以淀粉為碳源培養(yǎng)的病原菌發(fā)酵液及其對根皮苷的降解作用 發(fā)酵液的發(fā)酵方法與根皮苷為碳源的方法一致，發(fā)酵培養(yǎng)30 d左右，用濾膜過濾，將得到的無菌發(fā)酵液稀釋至含根皮苷0．1 g/L，搖勻靜置10 d后檢測根皮苷含量，檢測過程中以0．1 g/L根皮苷溶液作為對照物。

2.3 有機酸、蛋白類物質(zhì)對根皮苷的降解作用 首先，將以離子交換樹脂進行溶脹處理，隨后用4%鹽酸浸泡0．5 h后抽濾，用二次水洗至中性。然后，用3%氫氧化鈉溶液浸泡0．5 h，再進行抽濾并洗至中性。將預(yù)處理好的樹脂裝柱，將無菌發(fā)酵液倒入柱子中，使有機酸交換到陰離子交換樹脂中，過完柱子后用0．15 mol/L的氨水進行脫洗，脫洗后的溶液減壓蒸餾出去殘留氨水，用鹽酸調(diào)至pH為3．5，得到有機酸液。在有機酸液中加入硫酸銨，沉淀發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)，用半透析膜進行透析處理得到粗蛋白液，將粗蛋白液進行冷凍干燥，得到蛋白類物質(zhì)。發(fā)酵剩余液即除去有機酸和蛋白類物質(zhì)之后的發(fā)酵液。將0．1 g/L的根皮苷水溶液作為對照標(biāo)準(zhǔn)，分別檢測含根皮苷0．1 g/L的有機酸溶液、含根皮苷0．1 g/L的發(fā)酵剩余液以及漢根皮苷0．1 g/L、蛋白類物質(zhì)1 g/L的水溶液。再分別配制含根皮苷0．1 g/L以及不同濃度蛋白類物質(zhì)的水溶液，以空白物質(zhì)作為對比參照物，測定不同濃度蛋白類物質(zhì)對根皮苷降解的影響。對于根皮苷降解時間的影響則用含根皮苷0．1 g/L、蛋白類物質(zhì)0．1 g/L的水溶液，分別在室溫下靜置降解不同時間[2]。

3 試驗結(jié)果

3.1 蘋果樹腐爛病菌對根皮苷的降解作用 以根皮苷為碳源培養(yǎng)的腐爛病菌中，每100 mL發(fā)酵液含干質(zhì)菌絲48 mg，說明蘋果樹腐爛病菌是以根皮苷作為碳源的。在病原菌發(fā)酵后，檢測到的根皮苷低于不接菌培養(yǎng)的對照物，并且病原菌對根皮苷的利用率高達90%。

3.2 蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液對根皮苷的降解作用 通過淀粉培養(yǎng)的無菌發(fā)酵液在處理根皮苷后，發(fā)酵液中幾乎不含根皮苷，說明發(fā)酵液中含有特定物質(zhì)可以徹底降解根皮苷，而且無菌發(fā)酵液降解根皮苷的效率為99%以上。

3.3 發(fā)酵液中各其他成分對根皮苷的降解作用 之前分別提取了有機酸、蛋白類物質(zhì)及發(fā)酵剩余液，并分別進行了根皮苷的降解試驗，目的是為了找出發(fā)酵液中能夠降解根皮苷的物質(zhì)種類。經(jīng)過對試驗結(jié)果的分析，有機酸與發(fā)酵剩余液在試驗后的溶液中根皮苷含量幾乎沒有變化，說明這兩種物質(zhì)根皮苷幾乎沒有降解作用。而蛋白類物質(zhì)在試驗后溶液中根皮苷含量明顯降低，其對根皮苷的降解率在90%，說明發(fā)酵液中蛋白類物質(zhì)才是降解根皮苷的主要活性物質(zhì)。經(jīng)推測，這些蛋白類物質(zhì)的作用與降解細胞壁酶類相似。而且由試驗結(jié)果可知，時間越長，蛋白類物質(zhì)越多，對根皮苷的降解作用越明顯。

4 結(jié)論

該文通過試驗證明了根皮苷被蘋果樹腐爛病菌作為碳源長期利用的原因為：蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵過后生成了某種特殊物質(zhì)，從而產(chǎn)生了能夠降解根皮苷的能力。隨后又通過試驗表明，蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)是降解根皮苷的主要物質(zhì)。發(fā)酵液中存在的有機酸類及發(fā)酵剩余液中其他物質(zhì)對根皮苷的降解作用非常低，幾乎不具有降解根皮苷的能力。至于蛋白類物質(zhì)中何種物質(zhì)起到主導(dǎo)作用，目前還無法確定，有待進一步研究。

[1]2017年蘋果樹腐爛病防控技術(shù)方案[J]．山東農(nóng)藥信息，2017（5）：22．

[2]鄭慶偉．丁香酚、愈創(chuàng)木酚對蘋果樹腐爛病病原菌均有抑制效果[J]．農(nóng)藥市場信息，2017（20）：122-123．