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    光譜法研究根皮苷與人血清白蛋白相互作用

    2013-11-28 01:00:30王迎進(jìn)張艷青李亞雄李艷芳張海容
    分析測試學(xué)報(bào) 2013年2期
    關(guān)鍵詞:皮苷能量轉(zhuǎn)移色氨酸

    王迎進(jìn),張艷青,李亞雄,李艷芳,張海容

    (生化分析技術(shù)研究所 忻州師范學(xué)院,山西 忻州 034000)

    根皮苷(Phlorizin)是一種具有明顯生物活性的天然化合物,其化學(xué)成分是1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-丙酮,主要從蘋果、蘋果樹皮及葉中提取而得?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明根皮苷具有抗氧化、抗腫瘤及防治糖尿病、美白等生理功效[1-3]。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中最豐富的功能蛋白,也是人體內(nèi)重要的小分子藥物結(jié)合蛋白,具有運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、氨基酸以及多種藥物功能[4]。深入研究HSA與藥物小分子的結(jié)合作用,不僅可以從分子水平上闡述藥物小分子的藥效作用機(jī)理,而且對藥物的體外篩選、合理開發(fā)利用以及設(shè)計(jì)更加有效的藥物分子具有重要的理論指導(dǎo)意義。因此,HSA與藥物小分子的相互作用研究已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的重要研究課題。目前有關(guān)根皮苷與HSA的相互作用研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜和紫外光譜法研究了根皮苷與HSA的相互作用機(jī)理,得到了根皮苷與HSA相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合距離,根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了其相互作用力類型,采用同步熒光光譜法研究了根皮苷對HSA構(gòu)象的影響,并考察了5種金屬離子對根皮苷與HSA結(jié)合作用的影響,為闡明根皮苷在體內(nèi)的輸送和代謝過程、了解其生物學(xué)作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    RF-5301型熒光分光光度計(jì)、UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);501A型超級數(shù)顯恒溫水浴(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)。

    人血清白蛋白(99%,Sigma公司):稱取HSA配制成1.5×10-5mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)液,置于冰箱中4℃保存。根皮苷(95%,北京索萊寶科技有限公司):準(zhǔn)確稱取根皮苷配制成5.0×10-5mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液;Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水,其它試劑均為分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    準(zhǔn)確移取一定體積的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中,加入3.5 mL HSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,以Tris-HCl緩沖溶液定容至5 mL,恒溫水浴30 min。以285 nm為激發(fā)波長,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,恒溫掃描一定波長范圍內(nèi)HSA的熒光光譜、HSA在根皮苷作用下的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜(Δλ=15、60 nm)及紫外吸收光譜。

    圖1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of phlorizin-HSA system 303 K;cHSA=1.05×10-6mol·L-1;cphlorizin(1-10):0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0(×10-6mol·L-1)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜

    蛋白質(zhì)因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而能發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在選定條件下,考察了不同濃度根皮苷溶液對BSA熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖1所示。HSA在330 nm處有較強(qiáng)的熒光,隨著根皮苷濃度的增加,HSA在330 nm附近的熒光強(qiáng)度被有規(guī)律地猝滅,說明根皮苷與HSA發(fā)生了相互作用,導(dǎo)致HSA發(fā)生熒光猝滅。

    2.2 熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的測定

    引起HSA熒光猝滅的原因可能有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光分子之間因彼此擴(kuò)散和碰撞導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光減弱的現(xiàn)象,其猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[5]。

    圖2 不同溫度下根皮苷-HSA體系的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer curves of phlorizin-HSA system at temperatures of 293,303,313 K

    式中:F0和F分別為未加入和加入根皮苷時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅過程的猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1);τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命;Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)(L·mol-1)。生物大分子的熒光壽命約為 10-8s[6],故可根據(jù)猝滅常數(shù)Ksv求得猝滅速率常數(shù)Kq。

    靜態(tài)猝滅是由于猝滅劑與熒光物質(zhì)相互作用而生成了一定構(gòu)型化合物,導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。靜態(tài)猝滅過程符合Lineweaver-Bruk雙倒數(shù)方程[7]:

    式中:KLB為猝滅劑與熒光物質(zhì)的結(jié)合常數(shù),也稱作Lineweaver-Bruk猝滅常數(shù)。隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)增大,而靜態(tài)猝滅常數(shù)隨之減小,由此可判斷熒光猝滅類型。

    按實(shí)驗(yàn)方法分別測定293、303、313 K時(shí)體系的熒光猝滅光譜,據(jù)式(1)作HSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線(圖2),據(jù)式(2)作雙倒數(shù)曲線,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r,可計(jì)算得到猝滅常數(shù)Ksv及結(jié)合常數(shù)KLB(表1)。

    表1 根皮苷-HSA體系的猝滅反應(yīng)常數(shù)Table 1 Quenching constants of phlorizin-HSA system

    由圖2和表1可知,隨著溫度升高,根皮苷與HSA作用的猝滅曲線斜率降低;根皮苷對HSA熒光猝滅過程的Kq值遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大 Kq值(2 ×1010L·mol-1·s-1);結(jié)合常數(shù) KLB隨溫度的升高而減小;均證明根皮苷對HSA的熒光猝滅不是動(dòng)態(tài)猝滅,而是因根皮苷與HSA之間形成了配合物而引起的靜態(tài)猝滅[8]。

    圖3 根皮苷對HSA的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of phlorizin-HSA system cHSA=1.05×10-6mol·L-1;cphlorizin(1-10)=0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0(×10-6 mol·L-1),293 K

    2.3 根皮苷與HSA的紫外吸收光譜

    紫外吸收光譜是檢測是否生成復(fù)合物的一種簡單有效方法,根皮苷與HSA相互作用的紫外吸收光譜如圖3所示,由圖3可知,HSA在278 nm處有一強(qiáng)吸收峰,當(dāng)加入根皮苷后,吸收強(qiáng)度隨根皮苷濃度的增加逐漸增強(qiáng),且HSA的最大吸收峰發(fā)生明顯紫移(從278 nm減小到266 nm)。進(jìn)一步證明了根皮苷與HSA形成了基態(tài)復(fù)合物[9]。

    2.4 根皮苷與HSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

    對于靜態(tài)猝滅,熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由結(jié)合常數(shù)表達(dá)式[10]推導(dǎo)求出。

    將lg[(F0-F)/F]對 lg[Q]作圖,根據(jù)截距和斜率可求得相應(yīng)Kb和n。結(jié)果如圖4及表2所示。由表2可知,根皮苷與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1,說明根皮苷與HSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合常數(shù)Kb值較大(在105數(shù)量級),且隨著溫度的升高而降低,表明根皮苷與HSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用,可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

    2.5 根皮苷與HSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

    分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用。當(dāng)溫度變化不大時(shí),反應(yīng)的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)可認(rèn)為是常數(shù),由熱力學(xué)公式可計(jì)算根皮苷與HSA相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值。由表3可知,根皮苷與HSA的相互作用過程是一個(gè)放熱熵減少過程。根據(jù)Ross等[11]總結(jié)的生物大分子與小分子作用力類型的熱力學(xué)規(guī)律,結(jié)合過程ΔrHm<0,ΔrSm<0,可以推測根皮苷與HSA形成復(fù)合物歸因于氫鍵和范德華的形成。這與根皮苷結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)羥基,易形成氫鍵的事實(shí)相符。而ΔrGm<0,表明根皮苷與HSA的相互作用是自發(fā)過程。

    圖4 根皮苷對HSA熒光猝滅的Lineweaver-Bruk圖Fig.4 Lineweaver-Bruk curves of HSA quenched by phlorizin

    表2 根皮苷-HSA體系的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 The binding constants and binding sites of phlorizin-HSA system

    2.6 根皮苷-HSA體系的同步熒光光譜

    Δλ為15、60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[12]。固定HSA濃度逐漸增加根皮苷濃度時(shí),記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜(圖5)。由圖可知,酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本不變,而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移,發(fā)射波長由339 nm紅移至343 nm。表明根皮苷的介入引起HSA構(gòu)象的變化,使色氨酸周圍微環(huán)境的親水性增強(qiáng),HSA結(jié)構(gòu)變得舒展,更易被水分子接近[13]。另外,色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低比酪氨酸殘基顯著,說明根皮苷與HSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

    表3 根皮苷與HSA結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of phlorizin-HSA binding procedure

    2.7 根皮苷與HSA作用距離計(jì)算

    根據(jù)F rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[14],可以求出小分子與蛋白質(zhì)分子中發(fā)射熒光基團(tuán)之間的距離,距離越小,藥物分子越易于被蛋白質(zhì)儲(chǔ)存與運(yùn)輸,越能發(fā)揮其藥理作用,能量轉(zhuǎn)移效率E與給體-受體間距離r的關(guān)系為:

    能量轉(zhuǎn)移效率(E)為50%時(shí),臨界距離R0(福斯特距離)為:

    式中,K為供體和受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的取向因子,n為介質(zhì)的折射指數(shù),ΦD為給體的熒光量子產(chǎn)率,J為供體的發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。

    只要得到E、K2和n并通過測定光譜求出積分J,就可計(jì)算出R0和r。

    HSA的熒光光譜和根皮苷的吸收光譜如圖6所示,將光譜重疊部分分割成極小的矩形,通過式(6)求得重疊積分 J(v)=7.54 ×10-15。

    上述實(shí)驗(yàn)條件下,取向因子供體受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值K2=2/3,n折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值n=1.336,ΦD=0.118,將上述數(shù)值代入式(5)求得R0=2.34 nm。再用根皮苷與HSA等摩爾混合后的熒光強(qiáng)度,通過式(6)計(jì)算得到能量轉(zhuǎn)移效率E=0.04。經(jīng)式(4)求得根皮苷與色氨酸殘基的最短距離r=3.97 nm,說明根皮苷與HSA足夠靠近(r<7 nm),其結(jié)合是通過非輻射能量轉(zhuǎn)移促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。

    圖5 根皮苷-HSA體系的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of phlorizin-HSA system

    圖6 HSA的熒光光譜與根皮苷的吸收光譜Fig.6 Fluorescence spectra of HSA and the absorption spectra of phlorizin

    2.8 金屬離子干擾

    生物體內(nèi)含有多種微量金屬元素,這些元素共同參與各種生命活動(dòng)。研究微量元素與生物體的作用機(jī)理,可以深入了解微量元素在生物體內(nèi)的生理功能。因此,研究了 Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+5種金屬離子對根皮苷-HSA結(jié)合體系的影響,結(jié)果見表 4。由表 4可知,Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+的介入對根皮苷與 HSA的結(jié)合常數(shù)影響較小。而Mg2+的介入使根皮苷與HSA的結(jié)合常數(shù)增加了1個(gè)數(shù)量級,原因可能是Mg2+在根皮苷與HSA分子之間起到“離子架橋作用”,形成了根皮苷-Mg2+-HSA 復(fù)合物[15]。

    3 結(jié)論

    根皮苷對HSA的熒光存在猝滅作用,其熒光猝滅過程是由于形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅,且發(fā)生了分子內(nèi)的非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力關(guān)系確定二者之間主要以氫鍵及范德華力相互作用;同步熒光光譜表明根皮苷主要與HSA的色氨酸殘基相互作用,并能改變其局部構(gòu)象;而金屬離子的存在會(huì)影響根皮苷與HSA間的結(jié)合能力。

    表4 金屬離子對根皮苷-HSA體系結(jié)合常數(shù)的影響(293 K)Table 4 Effects of metal ions on binding constant of phlorizin-HSA system(293 K)

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