超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定牛奶中不同類型的11種獸藥殘留

方慧文，盧躍鵬，周 原，江小明，楊 永

(武漢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 國家飲料及糧油制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(武漢)，湖北 武漢 430048)

四環(huán)素類、青霉素類、磺胺類和泰樂菌素常被用于治療動物生長過程中的疾病，同時也造成這些藥物在動物細胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品(蛋、奶)中的殘留，直接影響人體健康。獸藥殘留的分析方法主要有微生物法［1－2］、高效液相色譜法［3－6］、氣相色譜質(zhì)譜法［7－9］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10－13］等。同時測定多類獸藥殘留的難點在于獸藥種類多，性質(zhì)相差較大，導致前處理方法因不能兼顧每種藥物而使回收率、定量下限等無法滿足測定要求，此外，基質(zhì)效應也給方法的建立帶來困難。由于以上原因，導致目前已報道的多類獸藥同時測定的方法［14－15］中前處理方法多較為復雜。近年來，靈敏度非常高的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的問世，為簡單快速、能夠同時測定多類獸藥殘留的前處理方法的建立提供了可能。

本文利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀高靈敏度的特點，建立了測定牛奶中四環(huán)素類、青霉素類、磺胺類和泰樂菌素的分析方法，該方法最大限度地減少了前處理過程中目標物的損失和基質(zhì)效應的影響，獲得了良好的測定結果，方法前處理簡單，試劑消耗少，測定時間短，結果準確可靠，已成功用于牛奶中四環(huán)素類、青霉素類、磺胺類和泰樂菌素的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API5500 QTRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司);Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);超聲波清洗儀(上?？茖Ч?;3－18K型冷凍離心機(德國Saitorius公司)。

土霉素、金霉素、四環(huán)素、青霉素G、氨芐青霉素、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、泰樂菌素均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化的超純水;甲醇(HPLC級，德國Merck公司);甲酸(美國Tedia公司);其它試劑均為分析純。

1.2 標準儲備溶液與工作溶液的配制

準確稱取適量的各獸藥標準物質(zhì)，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的混合標準儲備液(4℃冷藏保存)。使用時準確移取混合標準儲備液1.00 mL于100 mL容量瓶中并用乙腈定容，配成1.00 mg/L的混合標準溶液，再用起始流動相逐級稀釋成適當濃度的混合工作溶液。

1.3 儀器條件

色譜條件:色譜柱為Eclipse XDB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相為5 mmol/L甲酸溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序:0～5.0 min，90%～10%A;5.0～7.0 min，10%A;7.0～7.1 min，10%～90%A;7.1～10.0 min，90%A;流速為0.2 mL/min;柱溫40℃;進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件:離子源為ESI(+)，檢測方式為多反應檢測(MRM)，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500℃，源內(nèi)氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為60 psi，氣簾氣壓力為35 psi，駐留時間為20 ms。

1.4 樣品處理

準確稱取牛奶樣品5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL的離心管中，加入10 mL乙腈溶液，超聲提取10 min，提取液過0.2 μm濾膜后，用起始流動相稀釋10倍后上機測定。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇 乙腈是一種中等極性的提取溶劑，與大部分獸藥的極性較接近。此外，牛奶的主要成分為水(含量在86%～89%之間)，其它成分主要有干物質(zhì)、脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖等，乙腈具有沉淀蛋白的作用，在提取牛奶中殘留獸藥的同時，可沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)，離心后即可除去蛋白質(zhì)和部分固形物，達到凈化的效果，操作簡便、快捷。因此，本文選擇乙腈作為提取溶劑，并考察了牛奶與乙腈的體積比分別為1∶1、2∶3、1∶2時，牛奶中蛋白的沉淀量。結果發(fā)現(xiàn):當牛奶與乙腈的體積比為1∶2時，經(jīng)離心分離后，樣品溶液澄清透明，蛋白質(zhì)幾乎沉淀完全。

2.1.2 凈化方法的選擇 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀靈敏度非常高，采用稀釋提取液的凈化方法，可以簡化前處理過程，避免復雜前處理過程中目標物的損失，同時也降低了基質(zhì)效應對測定結果的影響。隨著稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)效應對測定結果的影響逐漸減小甚至消失，但會急劇降低方法的定量下限，因此，必須確定最佳稀釋倍數(shù)。本文用起始流動相將添加濃度為10.0 μg/kg(四環(huán)素類添加濃度為150 μg/kg)的樣品提取液分別稀釋2、5、8和10倍后上機測定，當稀釋倍數(shù)增加但峰面積基本不變時即為最佳稀釋倍數(shù)。稀釋樣品中各目標物與原樣品中對應的目標物峰面積的比值見表1。

由表1可見，隨著稀釋倍數(shù)的增加，磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的峰面積逐漸減小，而泰樂菌素的峰面積逐漸增大，其它幾種獸藥的峰面積基本保持穩(wěn)定。表明牛奶基質(zhì)對磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的響應存在增強效應，對泰樂菌素的響應存在抑制效應，當稀釋倍數(shù)達到10時，3種目標物的峰面積趨于穩(wěn)定，基質(zhì)效應基本消除，因此選擇最佳稀釋倍數(shù)為10倍。

表1 基質(zhì)效應對11種獸藥測定結果的影響Table 1 Matrix effect on the determination results of 11 veterinary drugs

2.2 儀器條件的優(yōu)化

本文的前處理將樣品進行了稀釋，因此，需通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件提高各獸藥的響應，從而降低方法的定量下限，使之滿足檢測標準的要求。本文采用內(nèi)徑為2.1 mm的C18液相色譜柱，以提高柱容濃度;采用梯度洗脫的方式，使絕大多數(shù)目標物在較高的有機相中流出，以提高其響應;在流動相中加入0.1%甲酸以提高目標物的離子化效率。最終確定的色譜條件見 “1.3”。

圖1 11種獸藥的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 11 veterinary drugs the numbers denoted were the same as those in Table 2

ESI+離子化模式下，在適當質(zhì)荷比范圍內(nèi)分別對11種獸藥作Q1全掃描，通過優(yōu)化溶劑和去簇電壓，找到了11種獸藥分子的［M+H］+母離子。然后采用子離子掃描模式，通過優(yōu)化碰撞能、去簇電壓、入口電壓等確定各對離子的最佳質(zhì)譜參數(shù)(見表2)。在以上儀器條件下，對11種獸藥標樣進行測定，其MRM譜圖如圖1所示，出峰順序(保留時間)見表2。

表2 11種獸藥的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS parameters for 11 veterinary drug analysis

2.3 線性范圍與定量下限

分別配制11種獸藥的系列混合標準工作溶液，在最佳實驗條件下進行測定，以定量離子對的峰面積為縱坐標(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制工作曲線，計算得到其線性方程、相關系數(shù)、線性范圍，以低濃度樣品連續(xù)進樣計算得到定量下限(S/N=10)，結果見表3。由表3可以看出，11種獸藥在各自的線性范圍內(nèi)線性關系良好，線性系數(shù)均大于0.998，定量下限為0.3～15 μg/kg。

表3 11種獸藥的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r)、定量下限、加標回收率及相對標準偏差Table 3 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，quantitation limits，spiked recoveries and RSDs of 11 veterinary drugs

2.4 加標回收率與精密度

在采集的樣品中任意選定1個空白樣品進行加標回收率和精密度測定，準確量取空白樣品5.0 g共18份，分別添加低、中、高3個濃度標準溶液，每個濃度平行測定6次，測定結果見表3。由表3可見，11種獸藥的回收率為81%～117%，相對標準偏差為0.6%～10.2%，表明本文所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

2.5 實際樣品的測定

應用本文所建立的方法，對武漢市內(nèi)采集到的50個批次的牛奶進行測定，在其中4個批次的原奶中檢出磺胺二甲嘧啶，含量在60～300 μg/kg之間，未發(fā)現(xiàn)其他種類的獸藥殘留。

3 結論

本文以牛奶中多類獸藥殘留的同時測定為研究對象，充分利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的高靈敏度，最大限度減少前處理過程中由于目標物性質(zhì)的較大差異造成的損失以及前處理過程的基質(zhì)效應對檢測的不利影響，成功建立了同時測定牛奶中多類獸藥殘留的方法，獲得了令人滿意的測定結果，為多類獸藥殘留的檢測研究提供了一種思路。

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