2 4-二硝基苯肼衍生/高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中總乙偶姻的含量

余書奇，晏日安，陳文銳，奚星林，劉 青，邵仕萍

(1.暨南大學(xué) 理工學(xué)院，廣東 廣州 510000;2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

乙偶姻(Acetoin)的化學(xué)名稱為3-羥基丁酮，是酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物，存在于酒精發(fā)酵的飲料中。乙偶姻也是雜菌對(duì)碳水化合物代謝的主要副產(chǎn)物之一，當(dāng)葡萄原料腐敗染雜菌或病變，漿果上生長(zhǎng)諸如醋酸菌等有害菌，或釀造過程中染雜菌時(shí)，可能導(dǎo)致葡萄酒中乙偶姻的含量超出正常范圍。而過多的乙偶姻可通過氧化產(chǎn)生雙乙酰，使酒精飲料出現(xiàn)酸敗的味道，是影響感官質(zhì)量的重要風(fēng)味物質(zhì)［1－2］。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道食品中乙偶姻的檢測(cè)方法主要為氣相色譜法［3－9］，而液相色譜法的報(bào)道較少。有報(bào)道采用溶劑提取食醋中的乙偶姻后直接經(jīng)紫外光譜檢測(cè)［1，10］，由于乙偶姻在紫外吸收處無特異性，干擾大，從而影響其回收率。乙偶姻含有酮基，可采用2 4-二硝基苯肼衍生后產(chǎn)生黃色的苯腙，在特定波長(zhǎng)內(nèi)檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外研究中，2 4-二硝基苯肼與醛酮反應(yīng)主要應(yīng)用于甲醛等物質(zhì)的檢測(cè)［11－16］。Ken等［9］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙偶姻的前體物質(zhì)α-乙酰乳酸能夠在實(shí)驗(yàn)條件下部分轉(zhuǎn)化成乙偶姻。本實(shí)驗(yàn)采用2 4-二硝基苯肼進(jìn)行柱前衍生，建立了適于葡萄酒體系中總乙偶姻(即游離乙偶姻及α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化生成的乙偶姻)含量的測(cè)定方法，應(yīng)用此方法，分析比較了正常發(fā)酵和異常發(fā)酵葡萄酒中總乙偶姻的含量，為判斷葡萄酒品質(zhì)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜儀(配有Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司);恒溫水浴箱(Julabo TW 20);振蕩器(IKA MS 3);0.45 μm濾膜。

乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99.9%，Supelco公司);乙腈(色譜純，美國(guó)Dikma公司);2 4-二硝基苯肼(純度＞99.0%);鹽酸、乙酸鈉(分析純)。

0.19%的2 4-二硝基苯肼(DNPH)溶液:稱取DNPH 150 mg用適量乙腈溶解定容至100 mL;1 mol/L鹽酸溶液:取9 mL鹽酸，加水定容至100 mL;5.0 g/L乙酸鈉溶液:取0.5 g乙酸鈉溶于適量水，加水定容至100 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Ultimate C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈－水(55∶45)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)363 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 衍生條件 由于干紅樣品中乙偶姻含量高于干白樣品，干紅樣品取0.2 mL進(jìn)行衍生反應(yīng)，干白樣品則取1 mL進(jìn)行衍生反應(yīng)。向樣液中加入0.1 mL 1 mol/L鹽酸溶液和2 mL 0.19%DNPH，加水定容至5 mL;加塞后混勻，室溫或30℃水浴1 h。冷卻后加入5 mL乙酸鈉溶液，混合均勻，過0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

1.2.3 自釀葡萄酒方法 取葡萄2組，每組5份，每份500 g。一組葡萄品質(zhì)良好，無破損腐敗顆粒，標(biāo)記為1#～5#。一組葡萄顆粒破損腐敗，標(biāo)記為6#～10#。葡萄去梗，帶皮破碎，轉(zhuǎn)入容器中，室溫下進(jìn)行第1次發(fā)酵，時(shí)間為7 d。轉(zhuǎn)移發(fā)酵液，并壓榨葡萄渣，將發(fā)酵液和壓榨液混合均勻后密封進(jìn)行第2次發(fā)酵，澄清后密封裝瓶，待檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

圖1 反應(yīng)酸度對(duì)乙偶姻峰面積的影響Fig.1 Effect of reaction pH value on peak area of acetoin

2.1 衍生條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生溶液的酸度 DNPH的衍生反應(yīng)為親核加成，是酸性催化反應(yīng)。體系的酸度對(duì)衍生能否完全非常重要。實(shí)驗(yàn)考察了pH值分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0時(shí)衍生產(chǎn)物苯腙的含量，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知在酸度減弱的情況下，衍生強(qiáng)度先略微增加后降低。原因可能為過多的氫離子與氨基結(jié)合，形成銨離子的衍生物，使得DNPH喪失了親核能力。因此實(shí)驗(yàn)確定pH 1.5為最佳反應(yīng)酸度，即加入0.1 mL 1 mol/L的鹽酸溶液。

2.1.2 衍生劑的用量 根據(jù)衍生反應(yīng)的比例關(guān)系及衍生劑需適當(dāng)過量的原則，在1 mL 10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品中分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL的DNPH進(jìn)行衍生反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。加入2.5 mL DNPH時(shí)，衍生產(chǎn)物含量達(dá)到最大值，但此時(shí)會(huì)產(chǎn)生不溶性的黃色物質(zhì)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)值下降。而加入2.0 mL DNPH時(shí)，衍生產(chǎn)物接近最大值，無不溶性物質(zhì)生成，r值達(dá)到0.999以上，回收率較高，因此選擇加入2.0 mL DNPH。

圖2 DNPH用量對(duì)乙偶姻峰面積的影響Fig.2 Effect of DNPH amount on peak area of acetoin

2.1.3 衍生反應(yīng)時(shí)間 考察了衍生時(shí)間分別為20、40、60、90、120 min時(shí)對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物苯腙的含量在反應(yīng)60 min后達(dá)到最大值，因此實(shí)驗(yàn)選擇60 min為最佳衍生時(shí)間。

2.1.4 衍生溫度 分別選擇20、30、40、50、60℃溫度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明衍生效率隨著溫度的升高而降低，在20～30℃時(shí)，衍生產(chǎn)物的產(chǎn)率高且較為穩(wěn)定，因此選擇室溫(20～30℃)作為最佳衍生溫度。

2.2 衍生后的樣品前處理

由于衍生后溶液的酸度較高，對(duì)柱子的使用壽命不利，因此嘗試采取以下2種方法對(duì)衍生后的溶液進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.1 有機(jī)溶劑提取 加入二氯甲烷5 mL，渦旋振蕩萃取1 min，取出上層溶液，再分別用2 mL和3 mL二氯甲烷再次萃取，合并3次萃取的下層溶液。將萃取溶液在40℃下氮吹15 min至干，再用二氯甲烷定容。由于氮吹后試管內(nèi)壁附著的黃色物質(zhì)用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等試劑均不能完全溶解，影響回收率，且萃取消耗有機(jī)試劑多，步驟繁瑣，因此不采用本方法進(jìn)行提取。

2.2.2 緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值 向衍生溶液中加入5 mL左右的5.0 g/L乙酸鈉溶液，使得溶液pH值為5.0，上機(jī)檢測(cè)，并與pH 1.5的色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，衍生產(chǎn)物無分解，響應(yīng)值不變，因此選擇加入緩沖溶液進(jìn)行衍生后處理。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 流動(dòng)相的選擇 分別考察了以甲醇－水和乙腈－水為流動(dòng)相時(shí)的色譜分離效果，結(jié)果顯示以乙腈－水為流動(dòng)相時(shí)，峰形尖銳無拖尾現(xiàn)象，且基線平穩(wěn)，而有機(jī)相改為甲醇后，響應(yīng)值降低，峰形拖尾，且出峰時(shí)間延后。因此選擇乙腈－水為最佳流動(dòng)相。

圖3 葡萄酒樣品的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of wine sample

2.3.2 流動(dòng)相的比例 考察了乙腈－水的體積比分別為70∶30、65∶35、55∶45、45∶55時(shí)葡萄酒樣品目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離情況。結(jié)果表明，流動(dòng)相中乙腈比例的提高可以加快分離過程，但乙腈比例太高時(shí)，目標(biāo)峰與附近的雜質(zhì)峰無法基線分離，對(duì)目標(biāo)峰造成干擾。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為55∶45時(shí)，目標(biāo)峰與附近雜質(zhì)峰的分離度為1.2，目標(biāo)峰的保留時(shí)間為7.343 min，分析時(shí)間較短(如圖3所示)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)相乙腈和水的體積比為55∶45。

2.3.3 流速與柱溫的選擇 考察了流速在0.5～1.2 mL/min范圍時(shí)對(duì)待測(cè)物分離的影響，結(jié)果表明，流速為1.0 mL/min時(shí)，峰的分離度佳且分析時(shí)間短。進(jìn)一步考察了柱溫的影響，分別在柱溫為25、30、35℃時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明柱溫30℃時(shí)基線平穩(wěn)且分離度佳。

2.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過二極管陣列檢測(cè)器在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，衍生產(chǎn)物的光譜圖見圖4。目標(biāo)物在363 nm處有最大吸收，且無其它物質(zhì)干擾，因此實(shí)驗(yàn)選擇363 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

分別吸取一定體積的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為 0、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的系列乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)工作液，取1 mL采用“1.2.2”方法進(jìn)行衍生，按照“1.2.1”方法進(jìn)行色譜分析。以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)求得線性回歸方程為Y=184 377X－260.25，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。圖5為30.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，按3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限為0.5 mg/L，按10倍信噪比計(jì)算方法的定量下限為1.67 mg/L。

2.5 精密度與回收率

隨機(jī)選取干紅和干白葡萄酒樣品進(jìn)行乙偶姻的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，干紅樣品中乙偶姻的本底濃度為21.2 mg/L，共設(shè)25、50、75 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平，干白樣品中乙偶姻本底濃度為3.0 mg/L，設(shè)置3、6、9 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平。同一加標(biāo)水平平行做6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。干紅樣品的加標(biāo)回收率為95%～106%，RSD為2.3%～3.4%;干白樣品的加標(biāo)回收率為94%～104%，RSD為2.5%～3.1%。

圖4 乙偶姻衍生產(chǎn)物的紫外可見光譜圖Fig.4 UV－Vis spectrum of derivatization production of acetoin

圖5 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.5 Chromatogram of derivatization production of acetoin standard

表1 葡萄酒樣品中乙偶姻的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Average recoveries of acetoin from wine sampe at three spike levels

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)50瓶葡萄酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中市售優(yōu)質(zhì)品牌進(jìn)口葡萄酒及合格國(guó)產(chǎn)干紅葡萄酒22瓶、干白葡萄酒8瓶、自釀葡萄酒10瓶以及購(gòu)自廣州增槎某批發(fā)市場(chǎng)偽劣葡萄酒(經(jīng)按國(guó)標(biāo)GB/T 15038檢測(cè)后證實(shí))10瓶，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)可知:①干紅葡萄酒中總乙偶姻的含量明顯高于干白葡萄酒含量，所測(cè)得的優(yōu)質(zhì)品牌進(jìn)口葡萄酒及合格國(guó)產(chǎn)干紅葡萄酒中乙偶姻含量為1.23～67.40 mg/L，其中干紅葡萄酒乙偶姻含量最高達(dá)67.40 mg/L，干白葡萄酒的最高含量則為6.40 mg/L;②自釀葡萄酒中顆粒腐敗破損的葡萄釀制葡萄酒的總乙偶姻含量顯著高于顆粒完整的葡萄釀制的酒樣。并且，由于在釀造過程中沒有添加SO2，使葡萄酒染上雜菌的幾率大為增加，因而自釀葡萄酒中總乙偶姻的含量遠(yuǎn)高于市售葡萄酒中總乙偶姻的含量;③國(guó)產(chǎn)偽劣葡萄酒中乙偶姻含量遠(yuǎn)高于進(jìn)口葡萄酒和國(guó)產(chǎn)品牌葡萄酒，最高達(dá)390.00 mg/L，說明國(guó)產(chǎn)偽劣葡萄酒可能使用了較為低劣的原料或者釀造過程污染了雜菌。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示釀酒過程中染菌或原料使用腐敗葡萄，均可能導(dǎo)致葡萄酒中總乙偶姻的含量過高。因此，總乙偶姻能作為衡量葡萄酒是否異常發(fā)酵的一個(gè)指標(biāo)，可為判斷葡萄酒品質(zhì)提供參考。

表2 樣品中總乙偶姻的含量Table 2 Content of total acetoin in wine samples

3 結(jié)論

本文建立了一種簡(jiǎn)單可行的葡萄酒中總乙偶姻的檢測(cè)方法，乙偶姻經(jīng)2 4-二硝基苯肼衍生后選用363 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，能排除組分干擾，方法的回收率理想。通過對(duì)自釀和市售的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口葡萄酒的檢測(cè)，說明總乙偶姻含量可以作為鑒證葡萄酒是否異常發(fā)酵的一個(gè)指標(biāo)，過高含量的乙偶姻說明葡萄酒釀造過程可能污染了雜菌或使用了腐敗的原料。

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