紅湘蓮蓮皮粉提取物的抗氧化性能

王 超，汪江英，時 磊，黃師榮

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭411105)

油脂和含油脂食品易于發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)的下降，甚至變質(zhì)。添加抗氧化劑能有效地防止食品氧化而變質(zhì)。近年來，合成抗氧化劑如BHA、BHT和TBHQ等由于有較大的毒副作用，現(xiàn)已被限制或停止使用［1－3］。許多研究表明，植物中的許多物質(zhì)，尤其是多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以延緩脂類氧化酸敗［3－4］，而且安全低毒。因而從植物材料中尋找天然抗氧化物質(zhì)越來越受到人們的歡迎，對植物提取物有效成分抗氧化活性的研究和開發(fā)日益受到重視。蓮皮粉是工業(yè)上生產(chǎn)磨皮蓮子的副產(chǎn)物，大約占蓮子重量的5%～10%。這些副產(chǎn)物通常被用作低效的肥料和動物飼料，或者當(dāng)作垃圾直接丟棄，未能充分利用，而且會污染環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)以紅湘蓮蓮皮粉為原料，選取甲醇和乙醇作為溶劑對蓮皮粉進(jìn)行提取，提取液經(jīng)減壓濃縮后制成提取物。用操作簡便、重現(xiàn)性較好、適應(yīng)性較強(qiáng)、成本較低的DPPH自由基清除法和還原力法研究了兩種提取物的清除自由基作用和還原能力，并用Schaal烘箱法，通過檢測油脂初期氧化產(chǎn)物的過氧化值和共軛二烯值以及檢測油脂氧化終產(chǎn)物的p－茴香胺值等指標(biāo)全面地研究了乙醇提取物的抗菜籽油的氧化作用，旨在為蓮皮粉的應(yīng)用開辟新的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅湘蓮蓮皮粉 由湖南宏興隆湘蓮食品有限公司提供;菜籽油(未添加任何抗氧化劑) 湖南省長康實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司;DPPH(1，1－二苯基－2－苦基肼)日本和光純藥工業(yè)株式會社;p－茴香胺(99%)百靈威科技有限公司;BHT(化學(xué)純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Folin酚試劑 合肥博美生物科技有限公司;無水甲醇、無水乙醇、沒食子酸、三氯乙酸、氯仿、冰乙酸、淀粉、異辛烷、碳酸鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、碘化鉀、硫代硫酸鈉均為分析純。

RE－2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;SPX－250B－D型振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV－2802SH型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DZ－2BCⅡ真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蓮皮粉提取物的制備 稱取在60℃下干燥至恒重的蓮皮粉20g，加入200mL無水甲醇或無水乙醇(1∶10，w/v)，在振蕩器上室溫下提取24h，真空抽濾，得到濾液。濾渣在相同條件下再提取一次，合并兩次濾液，在40℃以下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到提取物。

1.2.2 總酚含量測定 總酚含量按文獻(xiàn)［5］方法測定，稍作修改，具體操作如下:在1mL濃度為1mg/mL的提取物溶液中加入2.5mL稀釋10倍的福林酚試劑和2mL濃度為7.5g/100mL的碳酸鈉溶液，樣品在50℃下保溫5min后冷卻，以蒸餾水代替提取物作為對照，在760nm處測吸光度。用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為:A=14.286C+0.335，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，式中A為標(biāo)準(zhǔn)品溶液在760nm處的吸光度，C為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(mg/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為mg沒食子酸當(dāng)量/g提取物。

1.2.3 DPPH自由基清除作用的測定 按文獻(xiàn)［6］中的方法進(jìn)行測定。分別取不同濃度(0.2～5mg/mL)的提取物溶液3mL與3mL濃度為200μmol/L的DPPH乙醇溶液混合，使 DPPH的最終濃度為100μmol/L，振搖，置于暗處30min后于517nm處測吸光度，并以BHT作為陽性對照，按下式計算DPPH自由基清除率:

式中:Ac為3mL無水乙醇 +3mL DPPH溶液(200μmol/L)的吸光度;As為3mL提取物溶液+3mL DPPH溶液(200μmol/L)的吸光度;Ab為3mL無水乙醇+3mL提取物溶液的吸光度。

1.2.4 還原力測定 還原力測定按文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行，具體操作如下:分別取1mL不同濃度的提取物，與2.5mL磷酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH 6.6)和2.5mL 1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液充分混合，于50℃水浴條件下保溫20min后加入2.5mL 10%(w/v)的三氯乙酸，激烈振搖后離心10min，取上清液2.5mL與2.5mL蒸餾水和0.5mL三氯化鐵(0.1%，w/v)的混合液反應(yīng)30min后，于700nm波長處測吸光度。用BHT作為陽性對照。

1.2.5 蓮皮粉乙醇提取物抗菜籽油氧化實(shí)驗(yàn) 用Schaal烘箱法進(jìn)行。

1.2.5.1 油樣的制備 分別稱取提取物0.100、0.300g，BHT 0.020g于燒杯中，分別用3mL無水乙醇溶解，再加入菜籽油 100g，制備成 0.1%、0.3%和0.02%的混合液，空白組加3mL無水乙醇作對照。將上述所有樣品于室溫下在磁力攪拌器上攪拌5min，使添加物與油樣混合均勻，然后將油樣在40℃下真空干燥30min，以除去其中的乙醇。所得試樣敞口置于(60±1)℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中避光保存。每隔一定時間充分?jǐn)嚢枰淮尾⒔粨Q油樣在烘箱中的位置，每3d定時取樣測定油樣的過氧化值、p－茴香胺值和共軛二烯值。

1.2.5.2 過氧化值的測定 按文獻(xiàn)［1］中的方法進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取2.00～3.00g混勻的油樣于250mL碘量瓶中，加入氯仿－冰乙酸混合液(2∶3，v/v)30mL以溶解油樣，再加入1.00mL飽和 KI溶液，加塞振搖30s。在暗處放置10min后取出迅速加水100mL，搖勻后用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.002moL/L)滴定至淡黃色，再加入0.5%(wt%)淀粉指示液1.00mL，繼續(xù)用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失。平行測定3次，同時作空白實(shí)驗(yàn)。按下式計算樣品的過氧化值(POV，meq/kg):

式中:V1、V2分別為樣品、空白滴定時所消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL;C為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;m為油樣質(zhì)量，g。

1.2.5.3 p－茴香胺值的測定 按文獻(xiàn)［1］中的方法進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取油樣1.000～1.500g于25mL容量瓶中，用異辛烷溶解并稀釋至刻度，得油樣溶液。以異辛烷作參比，用1cm比色皿在350nm波長處測定油樣溶液的吸光度(Ab)。取具塞試管兩支，在第一支試管中加入油樣溶液5mL，在第二支試管中加入5mL異辛烷，再在兩支試管中各加入1mL濃度為0.25%(w/v)的p－茴香胺冰醋酸溶液，加塞后振蕩混勻。10min后，以第二支試管內(nèi)的溶液作參比，用1cm比色皿在350nm處測定第一支試管內(nèi)溶液的吸光度(As)。p－茴香胺值(AV)按下式計算:

式中:As為與p－茴香胺試劑反應(yīng)后油脂溶液的吸光度;Ab為油脂溶液的吸光度;m為油脂的質(zhì)量，g。

1.2.5.4 共軛二烯值的測定 按文獻(xiàn)［5］報道的方法進(jìn)行。稱取油樣0.02～0.04g，加入到25mL容量瓶中，用異辛烷定容至刻度，充分混合。用異辛烷做空白對照，在波長為234nm處測定油樣溶液的吸光度(A234)。按下式計算共軛二烯值(CD):

式中:A234為油樣溶液在234nm處的吸光度;L為比色皿長度，cm;C為油樣溶液的濃度，g/100mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取率和總酚含量

由于具有無毒和價廉等優(yōu)點(diǎn)，乙醇是從植物中提取抗氧化物質(zhì)的常用的有機(jī)溶劑。甲醇也是廣泛用于提取抗氧化物質(zhì)的有效溶劑，許多研究表明［8－9］，甲醇提取物的抗氧化活性最高，也最穩(wěn)定。在本研究中，用甲醇和乙醇作溶劑從紅湘蓮蓮皮粉中提取了抗氧化物質(zhì)，用Folin－Ciocalteu法測定了提取物中的總酚含量。所得提取物的提取率和總酚含量如表1所示。從表中可以看出，蓮皮粉的甲醇和乙醇提取物的提取率分別為16.10%±0.52%和5.97% ±0.71%，總酚含量分別為51.47±0.35、(99.7±0.88)mg沒食子酸當(dāng)量/g提取物。甲醇提取物的提取率是乙醇提取物的2.7倍，總酚含量卻為乙醇提取物的一半左右。這一結(jié)果表明，甲醇對蓮皮粉中的酚類物質(zhì)提取更有效。甲醇提取物的提取率較高，可能是由于甲醇的極性比乙醇大，提取的物質(zhì)相對較多的緣故。

表1 蓮皮粉提取物的提取率和總酚含量Table 1 Extraction yield and total phenolic content of the methanol and ethanol extracts from lotus seed peel

2.2 DPPH自由基清除作用

圖1給出了蓮皮粉提取物和BHT對DPPH自由基的清除作用。由圖可以看出，各樣品對DPPH自由基都有很好的清除作用，在一定濃度范圍內(nèi)對自由基的清除率隨濃度增大而逐漸增大，隨著濃度進(jìn)一步增大，對自由基的清除率趨于平穩(wěn)。濃度為0.2mg/mL時，甲醇提取物和乙醇提取物對自由基的清除率分別為85.58%和87.28%。這些結(jié)果表明，兩種提取物對DPPH自由基均有顯著的清除作用。但它們的清除作用比BHT的低。

圖1 蓮皮粉提取物對DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging activities of extracts from lotus seed peel

DPPH自由基清除作用的半抑制濃度 IC50為DPPH自由基的清除率達(dá)到50%時的樣品濃度，在一定程度上反映了抗氧化性能的強(qiáng)弱［10］。IC50越小，對自由基清除作用越大，抗氧化性也越強(qiáng)。通過origin程序擬合計算得出BHT、甲醇提取物和乙醇提取物對DPPH自由基清除作用的 IC50分別為:0.014、0.078、0.073mg/mL。各試樣對DPPH自由基清除作用的大小依次為:BHT＞乙醇提取物＞甲醇提取物。

2.3 還原力

還原力是物質(zhì)抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。許多研究表明［11－12］，植物提取物的抗氧化活性與其還原力存在對應(yīng)關(guān)系。

圖2為不同濃度的提取物的還原力。由圖可以看出，所有樣品的還原力均隨著濃度的增加而增加，所有濃度下各樣品均顯示出一定程度的還原能力。常用EC50來表征還原力的大小，表示在700nm處吸光度為0.5時對應(yīng)的測試樣品濃度，EC50越小，樣品的還原力越大，抗氧化性也越強(qiáng)。由圖2可以得到各樣品的還原力大小順序?yàn)?BHT＞乙醇提取物＞甲醇提取物。

圖2 蓮皮粉提取物的還原力Fig.2 Reducing power of extracts from lotus seed peel

2.4 乙醇提取物抗油脂氧化效果

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，蓮皮粉乙醇提取物的DPPH自由基清除力、總酚含量和還原力均高于甲醇提取物?？紤]到乙醇價格低廉，無毒以及更適合于食品級的抗氧化提取物的制備，研究了蓮皮粉乙醇提取物對菜籽油的抗氧化效果。

2.4.1 過氧化值 0.1%和0.3%的蓮皮粉提取物以及0.02%的BHT對菜籽油過氧化值的影響如圖3所示。由圖可知，所有樣品的過氧化值均隨著保藏時間的延長而逐漸增加，添加蓮皮粉乙醇提取物和BHT的油樣的過氧化值均低于空白組且較空白組增加緩慢，表明蓮皮粉提取物對菜籽油有一定的抗氧化作用。兩種濃度提取物的抗氧化作用均強(qiáng)于0.02%的BHT。結(jié)果表明蓮皮粉乙醇提取物能有效阻止菜籽油的氧化作用。

圖3 油樣的過氧化值隨時間的變化Fig.3 Changes in peroxide value over time in rapeseed oil samples

2.4.2 p－茴香胺值 p－茴香胺值是用來評價油脂氧化終產(chǎn)物的一項(xiàng)指標(biāo)，該值的大小可以直接反映油脂中醛類化合物含量的高低，進(jìn)而反映油脂的酸敗程度;p－茴香胺值越大，說明油脂氧化程度越高。圖4給出了不同菜籽油樣品的p－茴香胺值隨保藏時間的變化情況。由圖可以看出，所有樣品的p－茴香胺值均隨著保藏時間的延長而逐漸增加，添加蓮皮粉乙醇提取物和BHT的油樣的p－茴香胺值均比空白組的低，添加0.3%提取物的油樣的p－茴香胺值比添加0.1%提取物的低，表明蓮皮粉提取物能顯著抑制菜籽油的次級氧化產(chǎn)物的形成，而且，添加0.3%提取物的效果要好于添加0.1%的，但它們的效果均優(yōu)于0.02%的BHT。

圖4 油樣的p－茴香胺值隨時間的變化Fig.4 Changes in p－anisidine value over time in rapeseed oil samples

2.4.3 共軛二烯值 油脂在自動氧化過程中，會產(chǎn)生大量的共軛二烯酸，在234nm有最大吸收。共軛二烯值反映氧化早期階段脂質(zhì)氧化的程度，其值越大油脂的氧化穩(wěn)定性越低。圖5為各處理油樣的共軛二烯值隨時間的變化情況。由圖可知，各樣品的共軛二烯值隨著保藏時間的延長而增加，其中對照樣品增加的速率最大，表明蓮皮粉乙醇提取物具有一定的抗油脂氧化的潛力。對照樣品保藏18d后，其共軛二烯值從最初的5.27增加到21.23，顯著高于其他樣品的。添加兩種濃度的提取物均可顯著降低菜籽油樣品的共軛二烯值，它們的效果均強(qiáng)于0.02%的BHT。

圖5 油樣的共軛二烯值隨時間的變化Fig.5 Changes in conjugated dienes value over time in rapeseed oil samples

3 討論與結(jié)論

許多研究表明，酚類化合物對天然植物提取物的抗氧化活性有重要貢獻(xiàn)［13－14］。本研究發(fā)現(xiàn)，蓮皮粉乙醇提取物的總酚含量比甲醇提取物的高，乙醇提取物的DPPH自由基清除能力和還原力也更強(qiáng)。這一結(jié)果表明，提取物的抗氧化活性與其中的總酚含量有一定的相關(guān)性，提取物中的總酚含量對其抗氧化活性有較大的貢獻(xiàn)。

目前，用來評價植物和食品成分抗脂類氧化活性的測試方法種類眾多，常用的包括用來檢測脂類初期氧化產(chǎn)物的過氧化值法、共軛二烯值和硫氰酸鐵法，以及用來檢測脂類氧化終產(chǎn)物的硫代巴比妥酸測試法、p－茴香胺值法和羰基值法等。這些方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，單憑一種方法進(jìn)行評價還不足以具有說服力。要全面和科學(xué)地評價抗氧化物質(zhì)的對脂類的抗氧化活性，至少需要二種以上的方法進(jìn)行測定［15］。本研究用過氧化值法，共軛二烯值法和p－茴香胺值法全面地評價了蓮皮粉乙醇提取物對菜籽油的抗氧化作用。結(jié)果顯示添加0.1%和0.3%的提取物均可以有效地減緩油脂樣品過氧化值、共軛二烯值和p－茴香胺值的增加，而且效果比0.02%的BHT還強(qiáng)，添加0.3%提取物的效果要優(yōu)于添加0.1%的。這些結(jié)果說明提取物可以有效地抑制菜籽油氧化，而且抑制能力與添加量存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

蓮皮粉甲醇和乙醇提取物均具有較高的總酚含量以及較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和還原力，是有效的自由基清除劑，其中乙醇提取物的總酚含量更高，抗氧化性更強(qiáng)，兩者間存在一定的相關(guān)性。蓮皮粉乙醇提取物抗菜籽油氧化實(shí)驗(yàn)表明，提取物能有效地抑制油脂氧化，抑制能力與添加量具有劑量效應(yīng)關(guān)系，添加0.1%和0.3%提取物的抗氧化效果比0.02%的BHT還強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，蓮皮粉可作為食用油脂天然抗氧化劑的潛在來源。

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