凌云白毫總酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

冼麗清，李珊，馮彬，梁儉，劉曉鳳

1. 桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院（百色 533000）；2. 百色學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院（百色 533000）

凌云白毫主產(chǎn)于凌云、樂(lè)業(yè)兩縣，是廣西著名的土特產(chǎn)，因茶葉背面布滿(mǎn)白色絨毛而得名。與我國(guó)東部常見(jiàn)茶種不同，凌云白毫是一種喬木類(lèi)大葉茶種，所制茶葉以毛多、色翠、香高、味濃、耐泡等特色聞名于世?，F(xiàn)代生理學(xué)研究證實(shí)，長(zhǎng)期適度飲茶，對(duì)維護(hù)機(jī)體健康具有積極作用[1]，原因在于茶葉中含有大量具有重要生理功能的物質(zhì)，如總酚[2]、總黃酮[3]和生物堿[4]等。其中，總酚是茶葉主要的功能性物質(zhì)，其含量直接影響茶葉的等級(jí)與品質(zhì)[5]。因地方經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，凌云白毫品牌意識(shí)薄弱，國(guó)內(nèi)的受眾范圍極其狹窄，關(guān)于其生物活性物質(zhì)的提取及性質(zhì)研究基本處于空白狀態(tài)。針對(duì)這一現(xiàn)狀，試驗(yàn)以凌云白毫為原料，在超聲波輔助作用下提取總酚類(lèi)物質(zhì)，優(yōu)化提取工藝，并探討總酚的抗氧化活性，對(duì)比同類(lèi)型品牌茶葉、評(píng)估凌云白毫的品質(zhì)，為擴(kuò)大凌云白毫在國(guó)內(nèi)的知名度及受眾范圍提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

凌云白毫（綠韻有機(jī)綠茶，廣西凌云浪伏茶葉有限公司）。

沒(méi)食子酸、福林酚、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、抗壞血酸、無(wú)水碳酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

FW80高速多功能粉碎機(jī)（南京曉曉?xún)x器設(shè)備有限公司）；UV-27000島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]；820DP480W數(shù)顯功率可調(diào)超聲波（深圳市光點(diǎn)超聲波設(shè)備有限公司）；SHA-B恒溫水浴振蕩器（浙江力辰儀器科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凌云白毫總酚的提取及含量測(cè)定

1.2.1.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別移取0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL 1.000 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于7個(gè)50 mL容量瓶，用蒸餾水定容。再次轉(zhuǎn)移上述不同濃度的沒(méi)食子酸測(cè)試液各1.00 mL置于7個(gè)25 mL容量瓶，加入5.00 mL 10%福林酚溶液，于25 ℃振蕩5 min。繼續(xù)加入4.00 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容。振蕩60 min后，于765 nm測(cè)定體系吸光度A[6]，并以其對(duì)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度cA（mg/mL）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：A=121.5cA+0.008 2，R2=0.991 2。

1.2.1.2 總酚的提取及含量測(cè)定

稱(chēng)取凌云白毫粉末樣品（0.250 mm，基準(zhǔn)量0.200 0 g），按一定比例混合乙醇-水溶液，在預(yù)先設(shè)定好的超聲時(shí)間、提取溫度及超聲功率等條件下超聲提取，反復(fù)2次。合并提取液并濃縮至30 mL，濾至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容即得凌云白毫總酚提取液[7]。按照1.2.1.1小節(jié)所示流程測(cè)定總酚提取液吸光度，代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算總酚質(zhì)量濃度col（mg/mL），并按式（1）計(jì)算總酚提取率。

式中：col為總酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為總酚提取液體積，mL；m為茶葉樣品質(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.200 0 g凌云白毫粉末樣品，固定超聲時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃、液料比40∶1（mL/g）、超聲功率160 W，測(cè)定總酚在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%和90%）下的提取率；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度70 ℃、液料比40∶1（mL/g）、超聲功率160 W，測(cè)定總酚在不同超聲時(shí)間（20，25，30，35和40 min）下的提取率；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲時(shí)間20 min、液料比40∶1（mL/g）、超聲功率160 W，測(cè)定總酚在不同提取溫度（60，70，80，90和100 ℃）下的提取率；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃、超聲功率160 W，測(cè)定總酚在不同液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）]下的提取率；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃、液料比40∶1（mL/g），測(cè)定總酚在不同超聲功率（100，120，140，160和200 W）下的提取率[8]。

1.2.3 凌云白毫總酚提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

依據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的總酚單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取其中顯著影響總酚提取效果的因素并截取主要水平，以總酚提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件中的Box- Behnken法優(yōu)化提取方案[9-10]，如表1所示。

表1 Box-Behnken法優(yōu)化試驗(yàn)方案

1.2.4 凌云白毫總酚的純化

稱(chēng)取5 g已預(yù)處理的XDA-5大孔樹(shù)脂于250 mL反應(yīng)瓶中，加入50 mL總酚提取液，于25 ℃振蕩24 h。大孔樹(shù)脂吸附飽和后，經(jīng)抽濾、洗滌轉(zhuǎn)移至另一潔凈的250 mL反應(yīng)瓶中，加入100 mL 70%乙醇-水溶液，于25 ℃振蕩直至總酚完全解吸附[11]。抽濾，測(cè)定濾液中總酚質(zhì)量濃度并配制不同質(zhì)量濃度（10，20，30，40和50 μg/mL）的總酚待測(cè)液。

1.2.5 凌云白毫總酚體外抗氧化活性測(cè)試

1.2.5.1 總酚對(duì)·OH清除效果的測(cè)定

向5支裝有2.00 mL不同質(zhì)量濃度總酚待測(cè)液的潔凈試管中依次加入2.00 mL 8.000 mol/L硫酸亞鐵溶液、2.00 mL 9.000 mol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻后繼續(xù)加入2.00 mL 1.0%過(guò)氧化氫-水溶液。于25 ℃振蕩1 h，在510 nm處測(cè)定體系吸光度Mx[12]。相同的試驗(yàn)流程，蒸餾水代替總酚待測(cè)液作空白體系并測(cè)定M0（空白吸光度）；蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液作對(duì)照體系并測(cè)定Mp（對(duì)照吸光度），按式（2）計(jì)算凌云白毫總酚對(duì)·OH的清除率。

1.2.5.2 總酚對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

向5支裝有2.00 mL不同質(zhì)量濃度總酚待測(cè)液的潔凈試管中加入2.00 mL 1.000×10-5mol/L DPPH-乙醇溶液。在黑暗環(huán)境中，該體系于25 ℃振蕩40 min，在290 nm處測(cè)定體系吸光度Px[13]。相同的試驗(yàn)流程，無(wú)水乙醇代替總酚待測(cè)液作空白體系并測(cè)定P0；以無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液作對(duì)照體系以測(cè)定Pp，按式（3）計(jì)算凌云白毫總酚對(duì)DPPH自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚提取率的作用效果

如圖1所示，總酚提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)＜70%時(shí)隨其增加而升高，而后迅速下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，總酚提取率為13.35%，為所測(cè)最高值。因而，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為70%比較合適。

圖1 總酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總酚提取率的作用效果

如圖2所示，總酚提取率在超聲時(shí)間＜25 min時(shí)隨其增加而升高，而后有所下降。當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，總酚提取率為12.70%，為所測(cè)最高值。因而，超聲時(shí)間設(shè)定為25 min比較合適。

圖2 總酚提取率隨超聲時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.1.3 提取溫度對(duì)總酚提取率的作用效果

如圖3所示，總酚提取率在提取溫度＜80 ℃時(shí)隨其增加而升高，而后迅速下降。當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，總酚提取率為13.15%，為所測(cè)最高值。因而，提取溫度設(shè)定為80 ℃比較合適。

圖3 總酚提取率隨提取溫度的變化趨勢(shì)

2.1.4 液料比對(duì)總酚提取率的作用效果

如圖4所示，總酚提取率隨液料比的增加而升高并最終趨近于平衡狀態(tài)。當(dāng)液料比為50∶1（mL/g）時(shí)，總酚提取率為12.88%，為所測(cè)最高值。因而，液料比設(shè)定為50∶1（mL/g）比較合適。

圖4 總酚提取率隨液料比的變化趨勢(shì)

2.1.5 超聲功率對(duì)總酚提取率的作用效果

如圖5所示，總酚提取率在超聲功率＜160 W時(shí)隨其增加而升高，而后開(kāi)始下降。當(dāng)超聲功率為160 W時(shí)，總酚提取率為9.7%，為所測(cè)最高值。因而，超聲功率設(shè)定為160 W比較合適。

圖5 總酚提取率隨超聲功率的變化趨勢(shì)

2.2 凌云白毫總酚提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲功率為次要因素。令總酚提取率為響應(yīng)值（Y），乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、提取溫度（C）及液料比（D）為自變量，利用Design-Expert軟件優(yōu)化試驗(yàn)方案。試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的方差分析

以表2中結(jié)果為依據(jù)，利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)其進(jìn)行回歸分析，獲得凌云白毫總酚提取率（Y）對(duì)所考察4個(gè)因素的回歸模型：

表3為該回歸模型的方差分析結(jié)果[14-15]。該模型p＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)p=0.152 4＞0.05，不顯著，說(shuō)明未考察因素對(duì)所得數(shù)據(jù)的影響可忽略，隨機(jī)誤差是生成殘差的主要誘因。決定系數(shù)R2=0.969 7，校正系數(shù)Radj2=0.939 4，可知該模型能夠良好地匹配實(shí)際操作過(guò)程。

表3 方差分析表

所考察因素及其二次項(xiàng)可極顯著影響總酚提取率（p＜0.01），影響效果的顯著順序?yàn)锳＞C＞B＞D。此外，各因素間存在交互作用，其中交互作用AB極顯著（p＜0.01），交互作用BC、CD顯著（p＜0.05），其他交互作用AC、AD、BD不顯著（p＞0.05）。

2.2.3 凌云白毫總酚提取工藝最佳參數(shù)的確定

利用Design-Expert對(duì)回歸模型進(jìn)行最優(yōu)化處理，獲取凌云白毫總酚提取工藝的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、超聲時(shí)間21 min、提取溫度81 ℃、液料比46∶1（mL/g）、超聲功率160 W。在此條件下平行試驗(yàn)5次，實(shí)測(cè)凌云白毫總酚平均提取率為19.26%，與模型預(yù)測(cè)值19.78%相當(dāng)（＜3%），說(shuō)明所得凌云白毫總酚的提取工藝條件合理、可行。

2.3 凌云白毫總酚體外抗氧化活性測(cè)試

2.3.1 總酚對(duì)·OH清除效果的測(cè)定

如圖6所示，總酚對(duì)·OH具良好的清除效果，其清除能力隨總酚質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且在高質(zhì)量濃度條件下清除率增速進(jìn)一步加快。當(dāng)總酚質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率可達(dá)84.92%，略高于西湖龍井總酚對(duì)·OH的清除能力，低于VC對(duì)·OH的清除能力。

圖6 總酚對(duì)·OH清除效果的測(cè)定

2.3.2 總酚對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

如圖7所示，總酚對(duì)DPPH自由基具有較好的清除效果，其清除能力隨總酚質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)并逐漸趨近于平衡狀態(tài)。當(dāng)總酚質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)75.74%，略高于西湖龍井總酚對(duì)DPPH自由基的清除能力，低于VC對(duì)DPPH自由基的清除能力。

圖7 總酚對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

3 結(jié)論

試驗(yàn)以凌云白毫（綠茶）為原料，在超聲波作用下提取其中的總酚類(lèi)物質(zhì)。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取方案，獲取該工藝的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，超聲時(shí)間21 min，提取溫度81 ℃，液料比46∶1（mL/g），超聲功率160 W。在此條件下實(shí)測(cè)總酚提取率為19.26%，與回歸模型預(yù)測(cè)值19.78%相當(dāng)（＜3%），說(shuō)明該工藝具有較高的使用價(jià)值。抗氧化活性測(cè)試表明總酚具有良好的抗氧化活性，其抗氧化能力隨總酚質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)總酚質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其對(duì)OH、DPPH的清除率分別可達(dá)84.92%和75.74%。該研究豐富了凌云白毫主要功能性物質(zhì)總酚的提取及抗氧化活性等方面的研究?jī)?nèi)容，為強(qiáng)化凌云白毫茶在國(guó)內(nèi)范圍的推廣提供一定的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。