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    抗凍蛋白研究進(jìn)展及其在新型食品冷凍工藝中的應(yīng)用

    2022-11-16 19:08:26龔弋航
    食品工業(yè) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:冰晶抗凍水分子

    龔弋航

    浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院(杭州 310058)

    食品冷凍是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,其關(guān)鍵步驟是生成冰晶,冰晶是影響食品品質(zhì)的重要因素[1],其形態(tài)及分布都將影響冷凍的效率和冷凍食品的質(zhì)量。在食品制冷過(guò)程中,控制冰的重結(jié)晶和水的相變是維持產(chǎn)品質(zhì)量的2種最重要的方法[2]。傳統(tǒng)的冷凍采用-50~ -40 ℃的冷風(fēng)直吹冷凍法,水分子聚集而成的冰晶在表面膨脹,破壞食材的細(xì)胞組織,因此在解凍時(shí)會(huì)出現(xiàn)“滲水現(xiàn)象”。大的冰晶還會(huì)導(dǎo)致乳狀液的破乳、泡沫結(jié)構(gòu)的坍塌和凝膠結(jié)構(gòu)的破壞。同時(shí)冷凍過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生濃縮效應(yīng),使得食品的顏色、氣味和品質(zhì)均出現(xiàn)比較大的破壞。現(xiàn)階段人民對(duì)于高品質(zhì)冷凍食品的物質(zhì)需求,督促更多性能優(yōu)良的新興冷凍工藝出現(xiàn)。抗凍蛋白作為重要的生物抗凍劑應(yīng)運(yùn)而生,被用于食品的生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)娜^(guò)程以提高冷凍食品的質(zhì)量。該文根據(jù)抗凍蛋白的研究進(jìn)展,結(jié)合其理化特性分析其在食品冷凍中的應(yīng)用和發(fā)展前景,從而為新型食品冷凍工藝的發(fā)展提供新的可能。

    1 抗凍蛋白概述

    1.1 來(lái)源和研究進(jìn)展

    抗凍蛋白(antifreeze proteins)亦稱熱滯蛋白,是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱。最初在19世紀(jì)60年代由Devries首次從南極魚類的血液中發(fā)現(xiàn)[3],后相繼在昆蟲、植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有類似功能的蛋白,第一次有報(bào)道的抗凍脂蛋白從莫拉菌株中分離出,證明AFPs普遍存在于魚類、植物、昆蟲、細(xì)菌和真菌中[4]。其中植物來(lái)源的抗凍蛋白的研究起步較晚,1992年Griffith等[5]在冬黑麥的葉子中發(fā)現(xiàn)AFPs,被研究的植物材料達(dá)40余種。

    1.2 抗凍蛋白的特性

    1.2.1 熱滯效應(yīng)

    由于冰點(diǎn)是固液相共存時(shí)的溫度,大多數(shù)溶液冰點(diǎn)和熔點(diǎn)基本相同。而AFPs能夠非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)卻對(duì)熔點(diǎn)沒(méi)有影響,因此添加了抗凍蛋白的食品冰點(diǎn)會(huì)低于熔點(diǎn),其冰點(diǎn)和熔點(diǎn)的差值稱為熱滯差值。AFPs的這種活性稱為熱滯活性[6]。

    1.2.2 重結(jié)晶抑制效應(yīng)

    晶體溶于溶劑或熔融以后,又重新從溶液或熔體中結(jié)晶的過(guò)程中,會(huì)發(fā)生冰晶之間的聚合以及冰晶形態(tài)的改變,從而對(duì)組織造成機(jī)械損傷。而抗凍蛋白具有重結(jié)晶抑制效應(yīng),添加AFPs可抑制溶液冰晶的再結(jié)晶現(xiàn)象,使小冰晶均勻分布。

    1.2.3 修飾冰晶的生長(zhǎng)形態(tài)

    另外,AFPs對(duì)冰晶的生長(zhǎng)修飾具有獨(dú)特作用,它可以在冰晶的表面與其結(jié)合改變冰晶的形態(tài)并抑制其生長(zhǎng)。在低溫環(huán)境下,冰晶由于受到AFPs的影響,其生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生改變,由正常冰晶的扁圓型生長(zhǎng)為六角形棱錐。隨AFPs的濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),冰晶的形態(tài)趨近針狀[7]。

    2 抗凍蛋白在冷凍中的作用機(jī)理

    2.1 冷凍中冰晶的形成

    水凍結(jié)是一種常見(jiàn)現(xiàn)象,冰晶形成的過(guò)程由2個(gè)過(guò)程組成:核的形成和晶粒的生長(zhǎng)[8]。在成核過(guò)程中,水分子結(jié)合形成有序的冰粒,這有助于水分子在顆粒表面排列成冰晶。在冰晶生長(zhǎng)階段,通過(guò)有序添加更多的水分子來(lái)增加核粒子的大小。冰晶的形態(tài)對(duì)溫度和過(guò)飽和度表現(xiàn)出復(fù)雜的依賴性。冰晶的凍結(jié)速率、質(zhì)量擴(kuò)散、導(dǎo)熱和水分子聚集最終決定冰晶的形態(tài)多樣性。冰晶的最終形態(tài)取決于溶液的溶質(zhì)、溫度和冰晶生長(zhǎng)速率,并且在不同的冰晶表面上生長(zhǎng)速率不同。冰晶在冷凍過(guò)程中還會(huì)發(fā)生變質(zhì)。由于小冰晶具有較大的比表面積和較高的自由能,其尺寸將增加,形成大冰晶,即發(fā)生重結(jié)晶。重結(jié)晶包括小冰晶的融化、大冰晶的生長(zhǎng)和冰晶的融合。重結(jié)晶的發(fā)生可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、損壞并導(dǎo)致細(xì)胞損壞,從而使冷凍技術(shù)失去其最初的優(yōu)勢(shì)[2,9]。

    2.2 食品系統(tǒng)中的冰晶

    在冷凍過(guò)程中,食物系統(tǒng)中的化學(xué)反應(yīng)和微生物的生長(zhǎng)大大減少,有利于食物的保存。但是,冷凍過(guò)程也涉及與物理和生化反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。其中,起主導(dǎo)作用的因素是冰晶的形成,隨之引起包括脂質(zhì)氧化、內(nèi)源性酶活化、蛋白質(zhì)的變性和聚集等一系列問(wèn)題。

    根據(jù)水的純度,冰的成核有2種形式:異質(zhì)成核或均質(zhì)成核。均質(zhì)成核通常發(fā)生在極純凈水系統(tǒng)中。但是,在非純凈的水系統(tǒng)中更容易發(fā)生異質(zhì)成核[2]。因此在食品系統(tǒng)中,結(jié)冰通常以異質(zhì)成核的方式進(jìn)行。在非均相成核過(guò)程中,水分子在懸浮的表面膜、外來(lái)顆?;虺珊藙┥暇奂删w[10]。在食品系統(tǒng)中,產(chǎn)品溫度下降到冰點(diǎn)時(shí),原子開始形成冰核,這種冰核是平衡周圍水分子的微小晶體。只要冰核的形成是穩(wěn)定的,就可能在冰核的固相和液相之間添加分子促進(jìn)其生長(zhǎng)。

    冷凍儲(chǔ)存期間食物的物理變化主要表現(xiàn)為開裂、重結(jié)晶、水分流失和遷移;化學(xué)變化主要包括風(fēng)味變差、脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)變性以及維生素和色素的降解。其中冰晶對(duì)冷凍食品的損害主要包括機(jī)械損害、重結(jié)晶、低溫濃縮和凍傷。冰晶可以通過(guò)機(jī)械應(yīng)力對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷,在冷凍儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)組織和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞將導(dǎo)致食物質(zhì)地的惡化。

    2.3 抗凍蛋白的幾種作用機(jī)理假說(shuō)

    抗凍蛋白按照來(lái)源的不同,可大致分為魚類抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白和細(xì)菌抗凍蛋白。由于不同抗凍蛋白組成結(jié)構(gòu)的差異,其抗凍機(jī)理也略有差別。

    關(guān)于抗凍蛋白作用機(jī)理的研究大多集中在魚類抗凍蛋白,而關(guān)于植物和昆蟲蛋白作用機(jī)制不十分明確,以下是2種主要的抗凍蛋白與冰晶結(jié)合的學(xué)說(shuō)。

    2.3.1 吸附抑制學(xué)說(shuō)

    1977年Raymond等[11]提出的吸附抑制學(xué)說(shuō)解釋了AFPs抑制冰晶增長(zhǎng)的機(jī)理,這也是目前接受最為廣泛的抗凍蛋白作用學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為,AFPs分子可以吸附在冰晶表面,與冰晶間的結(jié)合非常緊密,只有當(dāng)冰晶融化時(shí)兩者才會(huì)分離。外層的水分子不能接觸到晶核,而被AFPs分子覆蓋的冰晶表面停止生長(zhǎng)。

    一般晶體生長(zhǎng)的方向與晶體的表面垂直,如果有雜質(zhì)吸附在冰晶生長(zhǎng)的通道上,那必須有一個(gè)外力促使冰在雜質(zhì)上生長(zhǎng),使得冰晶表面的曲率變大,表面張力的增大導(dǎo)致體系平衡狀態(tài)的改變,局部凝固點(diǎn)的下降導(dǎo)致整個(gè)體系冰點(diǎn)降低。因此,在“吸附抑制”學(xué)說(shuō)中,抗凍蛋白的作用主要有抑制冰晶生長(zhǎng)和降低冰點(diǎn)。

    2.3.2 晶格匹配學(xué)說(shuō)

    “晶格匹配”模型由DeViles[12]在1983年提出。在“晶格匹配”模型中,冬季比目魚AFP-Ⅰ的兩親性α螺旋通過(guò)規(guī)律排布,突出螺旋外的Thr和Asx殘基,從而與冰晶棱面相結(jié)合。這一緊密的結(jié)合也使得水分子和冰晶直接難以直接接觸,冰晶的進(jìn)一步生長(zhǎng)受阻。

    Knight等[13]對(duì)于該學(xué)說(shuō)作出補(bǔ)充說(shuō)明,將AFPs限制冰晶整體生長(zhǎng)的作用歸結(jié)為“臺(tái)階固定”和“表面固定”,前者表現(xiàn)為冰晶a軸生長(zhǎng)受阻,后者表現(xiàn)為蛋白盡可能鋪滿冰晶表面,并認(rèn)為冰晶在生長(zhǎng)中會(huì)形成新的表面,而冰晶伴隨著新表面的形成會(huì)不可逆吸附更多AFPs,直到冰晶體被完全不能生長(zhǎng)的表面包圍。

    除了上述2種學(xué)說(shuō)外,還有“偶極子-偶極子”學(xué)說(shuō)、氫原子結(jié)合模型、剛體能量學(xué)說(shuō)等,分別從冰的晶體結(jié)構(gòu)、微觀原子角度和能量最小化的角度闡述抗凍蛋白的作用機(jī)理。

    3 在食品冷凍工業(yè)中的應(yīng)用

    抗凍蛋白對(duì)冰晶的抑制以及改善冷凍食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量的作用引起了人們的興趣和關(guān)注,因此其在食品冷凍中具有廣闊的應(yīng)用前景。

    3.1 基因工程技術(shù)

    通過(guò)抗凍蛋白基因工程,可使原本自身不含AFPs的動(dòng)植物體內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白,從而增強(qiáng)其抗寒能力。這一技術(shù)可用于冷凍食品原料的預(yù)處理上。運(yùn)用基因工程技術(shù)將AFPs的基因轉(zhuǎn)移到目標(biāo)食品原料上,使之表達(dá),從而增強(qiáng)其田間抗寒能力,提高采后貯藏加工特性[14]。

    運(yùn)用基因工程將異源高活性抗凍蛋白基因?qū)牍叩仁称分?,可以改善速凍產(chǎn)品在解凍過(guò)程中常出現(xiàn)的汁液流汁、軟爛,失去原有形態(tài)的問(wèn)題,提高速凍品質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)表明[15]導(dǎo)入抗凍蛋白基因的轉(zhuǎn)基因番茄可以在-6 ℃生存幾個(gè)小時(shí),且不發(fā)生形變。

    在基因工程領(lǐng)域,目前只有魚類AFPs基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制有了系統(tǒng)研究,因此一般認(rèn)為只能通過(guò)魚類AFPs改變食品原料的抗凍性。但在賴先軍等[16]研究中,將黃粉蟲抗凍蛋白基因TmAFP導(dǎo)入植物基因表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到抗凍甘薯,證實(shí)轉(zhuǎn)昆蟲抗凍蛋白基因可增強(qiáng)甘薯抗凍能力。由此可見(jiàn)抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因工程的基因來(lái)源在未來(lái)的研究中有望進(jìn)一步擴(kuò)大,不同物種適合何種來(lái)源的抗凍蛋白基因也是值得深入研究的方向。

    3.2 冷凍添加劑

    AFPs可以通過(guò)直接混合、浸泡、真空滲透等物理手段添加到食品中,減小冰晶形成和重結(jié)晶對(duì)冷凍食品質(zhì)構(gòu)的破壞,改善食品品質(zhì),延長(zhǎng)貨架期,因此一直被認(rèn)為是冷凍食品的天然抗凍劑。以下是一些常見(jiàn)的應(yīng)用實(shí)例。

    3.2.1 在冷凍乳制品中的應(yīng)用

    抗凍蛋白在食品中最成功的應(yīng)用是添加到冷凍乳制品中。冰淇淋在加工和貯藏過(guò)程中易受升溫或溫度波動(dòng)的影響,較大的冰晶尺寸和冰晶的重結(jié)晶會(huì)使冰淇淋質(zhì)地粗糙,失去原有的細(xì)膩口感。實(shí)驗(yàn)證明在冰淇淋中加入燕麥中提取的AFPs,能夠降低冷藏過(guò)程中溫度波動(dòng)對(duì)冰淇淋質(zhì)地的影響[17]。基于對(duì)AFPs對(duì)冰淇淋的冷凍保護(hù)作用的研究,AFPs可以用作冰淇淋的天然抗凍劑,通過(guò)改善冰淇淋的耐熔融性,提高其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,以減少由冷凍和溫度波動(dòng)引起的變質(zhì),提高冷凍乳制品的穩(wěn)定性。

    3.2.2 在冷凍肉制品中的應(yīng)用

    研究發(fā)現(xiàn)將肉浸泡在AFPs溶液中凍藏后可以明顯減小冰晶的大小并減少由于冷凍引起的組織損傷。抗凍蛋白以一定的方式與肉組織結(jié)合,但在肉中的擴(kuò)散需要一定時(shí)間。除了物理浸泡法,還可以通過(guò)在宰殺前對(duì)牛羊注射AFPs的方式改善冷凍肉品質(zhì)。在不同時(shí)間宰殺的羔羊中靜脈注射從南極鱈魚分離的AFPs,在真空包裝后將肉樣品在-20 ℃下保存2~16周。結(jié)果表明,在屠宰前1~24 h進(jìn)行AFPs注射可以減少冰晶的大小和解凍后的滲水現(xiàn)象[18]。

    3.2.3 在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

    面筋蛋白的理化性質(zhì)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在冷凍過(guò)程中會(huì)被冰晶破壞,從而導(dǎo)致面團(tuán)質(zhì)量下降,而AFPs可用作冷凍面團(tuán)的有益添加劑??箖龅鞍讓?duì)冷凍面團(tuán)質(zhì)地特性的影響研究表明,添加AFPs可以降低面團(tuán)的結(jié)冰水含量[19],從而使面團(tuán)更加柔軟和穩(wěn)定,顯著改善其發(fā)酵能力。此外,添加AFPs可以減弱凍融處理對(duì)水分流動(dòng)性的影響,影響冷凍面團(tuán)中水分分布并提高面團(tuán)的保水能力[20]。

    4 結(jié)語(yǔ)與展望

    科學(xué)家已對(duì)AFPs在食品中應(yīng)用的安全性和可行性進(jìn)行評(píng)估,認(rèn)為其本身既無(wú)毒性,其功能特性也不會(huì)產(chǎn)生任何顯著的毒理學(xué)作用,通過(guò)抑制冰晶的生長(zhǎng)并減少冰的重結(jié)晶,AFPs被認(rèn)為是提高冷凍食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量的自然選擇。但關(guān)于AFPs的研究大多還是停留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi),真正在食品生產(chǎn)領(lǐng)域還未得到廣泛應(yīng)用,下面對(duì)限制其應(yīng)用的主要原因進(jìn)行總結(jié):

    1) 天然存在的抗凍蛋白數(shù)量有限,并且純化活生物體中AFPs的成本非常高。正如上文所提到的,關(guān)于抗凍蛋白的提取大多還是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究,相對(duì)來(lái)說(shuō)提取規(guī)模比較小,應(yīng)用的對(duì)象也存在一定的局限。如果要在食品生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用,必須找到一種成本低、效率高的大規(guī)模提取方式,以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)效率和效益的雙收。

    2) AFPs的添加不適用于標(biāo)準(zhǔn)的混合工藝,在諸如巴氏殺菌等需要加熱或溫度變化較大的工藝流程中,AFPs會(huì)由于變性變得不穩(wěn)定。要實(shí)現(xiàn)抗凍蛋白在冷凍食品中的生產(chǎn)應(yīng)用,必須要有一套完整合理、不會(huì)對(duì)其生理生化特性造成損害的工藝流程。因此,需要結(jié)合抗凍蛋白的特殊理化特性,進(jìn)行工程技術(shù)和生產(chǎn)工藝方面的優(yōu)化改進(jìn),與其相適配的新型生產(chǎn)技術(shù)有待出現(xiàn)。

    3) 與大多數(shù)抗凍蛋白相似,通過(guò)基因工程制備的AFPs也面臨著低表達(dá)和活性喪失的問(wèn)題。目前已商業(yè)化生產(chǎn)的有抗凍糖蛋白和冬季比目魚的I型抗凍蛋白,但主要還是用于研究領(lǐng)域。目前已知的抗凍蛋白在商業(yè)化食品中的生產(chǎn)應(yīng)用為聯(lián)合利華的Breyers品牌的輕雙攪雪糕,作為食品和健康保健領(lǐng)域的巨頭,該企業(yè)已有含ISPs的產(chǎn)品出售,但其通過(guò)轉(zhuǎn)基因酵母菌生產(chǎn)的方式也令它面臨著一些爭(zhēng)議。

    AFPs一直是近年來(lái)科研工作者所關(guān)心的領(lǐng)域,針對(duì)其在食品生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用限制的原因,有以下主要方向值得進(jìn)一步研究探索。

    1) 基于AFPs在食品加工工藝流程中容易喪失活性的問(wèn)題,可以進(jìn)行新型AFPs的開發(fā),如利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行AFPs的重組表達(dá),并利用基因工程技術(shù)制備高活性重組抗凍蛋白。

    2) 除了天然ADPs,在化學(xué)合成AFPs方面,也應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研究其與食品體系中其他物質(zhì)的作用,并完善相關(guān)的安全性評(píng)價(jià)。另外,通過(guò)探索AFPs的類似物和模擬物的合成工藝,有望實(shí)現(xiàn)抗凍蛋白替代品的生產(chǎn)。

    3) AFPs的酶促修飾非常有前景,具有抗凍特性的產(chǎn)品可以通過(guò)用蛋白酶對(duì)明膠進(jìn)行酶促修飾來(lái)獲得。例如利用木瓜蛋白酶修飾的膠原蛋白肽具有抗凍活性。需要通過(guò)進(jìn)一步的研究,增加EMAFP的水平并加快其在冷凍食品中的進(jìn)一步應(yīng)用。

    另外,如何提高AFPs的分離產(chǎn)率,降低其應(yīng)用的成本也是亟待解決的問(wèn)題。隨著對(duì)抗凍蛋白及其凍藏理論不斷的深入研究及新技術(shù)的不斷應(yīng)用,AFPs將實(shí)現(xiàn)在商業(yè)化食品生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用,真正實(shí)現(xiàn)科技造福人類的生產(chǎn)方式。

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