烏賊墨多糖的制備及對睪丸化療性損傷的保護作用

樂小炎，原 林，林少杰，陶葉杏，谷毅鵬，劉華忠

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088;2.廣東海洋大學生物化學中心，廣東湛江524088)

烏賊墨已被證明是一種多功能生物活性物質，其主要成分有黑色素、蛋白質、多糖等。近年來，少量報道對SIP的構效關系進行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其生物學功能具有廣譜性，如抗菌及保鮮作用［1］、抗氧化［2］、增強免疫力［3］等。在近年來我們報道 SIP的化療保護功能之后，最近發(fā)現(xiàn)SIP能有效緩解CP導致的小鼠睪丸損傷，提高精子的數(shù)量和質量。上述生物學功能的發(fā)現(xiàn)是基于粗多糖的研究。有研究表明，硫酸葡聚糖在分子量為1ku時具有體外抗HIV活性，且活性隨著分子量的增加而增強，在10ku時達到最大［4］。因此，目前所報道的SIP功能的實現(xiàn)是某均一性多糖抑或協(xié)同作用的結果，仍不得而知，尚需進一步研究。本實驗通過分離純化某一分子量片段的SIP，探討其對睪丸化療性損傷的緩解作用，為進一步探討不同分子量多糖對其生物活性功能的影響提供理論基礎，也為我國烏賊墨的開發(fā)利用提供實際指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曼氏烏賊墨囊 湛江東豐批發(fā)市場，保藏在－20℃冰柜中冷凍備用;昆明小白鼠 廣東省醫(yī)學實驗動物中心;木瓜蛋白酶 北京鼎國生物技術有限公司;Dextran 系列標準品(T－10，10ku;T－20，20ku;T－40，40ku;T－70，70ku;T－110，110ku)Pharmacia Fine Chemicals公司;注射用環(huán)磷酰胺(CP)江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;Sephdex G－100 GE Healthcare;乳酸脫氫酶(LDH)、γ－谷氨酰轉肽酶(γ－GT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。KDC－160HR高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;FDU－1100真空冷凍干燥機 托普儀器有限公司;UV－2550紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司;DHL－A電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;N－1000旋轉蒸發(fā)儀 托普儀器有限公司;JY92－Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TENSOR27紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SIP的分離 取烏賊墨囊4℃解凍，剪取墨汁，加入等體積的 PBS(0.01mol·L－1，pH7.2)，超聲處理，浸泡 8h，8000r·min－1離心 50min 去除沉淀，重復 2次，再加入木瓜蛋白酶，50℃下水解90min，100℃滅酶失活10min，離心去除沉淀，然后加入四分之一體積的氯仿/正丁醇(體積比4∶1)，去除蛋白，重復3次，取上清液旋轉蒸發(fā)濃縮，加入4倍體積的乙醇沉淀，冷凍干燥，得白色粉末樣品。采用Sephdex G－100作為填料，柱規(guī)格(1.0cm×100cm)分離純化，0.2%的NaCl溶液作為流動相，流速為 0.5mL·min－1，每管收集2mL，蒽酮法檢測每管的含糖量，并合并同一峰下的樣品，冷凍干燥得到樣品。

1.2.2 純度鑒定和相對分子質量的測定 采用排阻高效液相色譜(SE－HPLC)分析，分別將不同分子量的葡聚糖標品 T10、T20、T40、T70、T110 配制成 3mg·L－1，分別進樣，記錄保留時間T。以T為橫坐標，lgM為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程。取純化樣品溶解，配成3mg·L－1，記錄 T，推算其相對分子質量。HPLC系統(tǒng)由島津 LC－20AT，RID－10A HPLC系統(tǒng)由島津LC－20AT，RID－10A示差檢測器組成(島津公司，日本)。色譜柱:Shodex Sugar KS－804(8 ×300mm);流動相:0.1mol/L NaNO3溶液;流速 1mL/min;柱溫:常溫。

1.2.3 紫外光譜分析 將樣品用超純水配成1mg·L－1的水溶液，在 190～400nm 進行光譜掃描。

1.2.4 紅外光譜分析 取樣品1mg，采用KBr壓片，在4000～400cm－1紅外波數(shù)范圍內進行掃描。

1.2.5 硫酸根含量的測定 采用氯化鋇－明膠法［4］。

1.2.6 睪丸損傷的測定 選60只性成熟的雄性昆明小白鼠(28～30g)，隨機分成六組，空白組A，模型組B(腹腔注射 CP，15mg/kg，1 次/周，持續(xù) 10 周)，陰性對照組C(灌胃SIP，80mg/kg，1 次/d，持續(xù)10 周)，治療組 D、E、F(腹腔注射 CP，15mg/kg，1 次/周和灌胃 SIP，劑量分別是 65、80、95mg/kg，1 次/d，持續(xù) 10周)，正常的給水、喂食及飼養(yǎng)。10周后，頸椎處死小鼠，稱重，快速取出睪丸組織，預冷的生理鹽水清洗，吸干水分，稱重。用預冷的0.85%的NaCl溶液將睪丸組織勻漿成10%組織勻漿液，LDH及γ－GT的活力采用試劑盒檢測。

1.2.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。兩組間比較用t檢驗，*p＜0.05，＊＊p＜0.01。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜分析

經(jīng)分離純化得到的SIP組分在波長190～400nm處的光譜掃描圖譜如圖1。圖譜顯示，此多糖的特征吸收峰在190nm左右，在260及280nm未發(fā)現(xiàn)特征吸收峰，說明該純化SIP不含有蛋白質和核酸成分。

圖1 SIP的UVProbe紫外掃描儀上掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of SIP

2.2 純度及分子量的測定

SIP的HLPC圖譜(見圖2)顯示，SIP峰型較對稱，純度高。

根據(jù)已知葡聚糖標準品相對分子質量(M)及保留時間(T)繪制標準曲線(見圖3)，得到回歸方程為T=－1.645lgM+15.95(R2=0.9999)，SIP的保留時間為8.434min，計算得SIP重均分子量為37068u。

圖2 SIP的HPLC圖譜Fig.2 HLPC profiles of SIP

圖3 葡聚糖分子質量標準曲線Fig.3 Calibration curve for relative molecularweight determination

表1 SIP和CP對小鼠體重、睪丸重量及睪丸指數(shù)的影響Table 1 Effect of SIP and CP on body，testicular weights and testis index

2.3 紅外光譜分析

SIP的紅外圖譜(見圖4)顯示存在多糖的特征吸收峰，即在3398cm－1左右是O－H和N－H伸縮振動的特征，2800cm－1左右是糖類 C－H 伸縮振動，1423cm－1左右是C－H變角振動。另外，在1648cm－1是由羧基C=O的伸縮振動產(chǎn)生，在820cm－1為C－O－S伸縮振動，1235cm－1是S=O的伸縮振動，比較弱，說明存在硫酸根基團，含量測定證實存在3%硫酸根。

圖4 SIP的紅外圖譜Fig.4 Infrared absorption spectrum of SIP

2.4 小鼠體重、睪丸重量及睪丸指數(shù)的變化

從表1數(shù)據(jù)顯示，SIP能緩解CP導致的小鼠體重、睪丸重量(p＜0.05，p＜0.01)、睪丸指數(shù)(與模型組、空白組無顯著性差異)的降低，不同治療組間緩解效果不顯著(p＞0.05)。模型組與對照組相比，CP導致小鼠體重、睪丸重量、睪丸指數(shù)分別下降了15.12%(p＜0.01)、25%(p＜0.01)、12.48%(p＜0.05)。除治療組D外，其他治療組的小鼠體重、睪丸重量得到明顯(p＜0.01)的改善，且小鼠體重與空白組無顯著(p＞0.05)差異。

2.5 睪丸標志性酶變化

圖5顯示，睪丸中γ－GT活力因SIP的治療得到明顯(p＜0.01)的改善。與空白組相比，CP導致γ－GT活力提高了1.71倍。與模型組相比，治療組降低了因CP導致γ－GT活力的增加，降低指數(shù)達35%左右，且各治療組間無顯著(p＞0.05)差異，同時與空白組無差異。

圖6顯示，SIP能緩解CP導致的LDH活力下降。CP明顯(p＜0.01)降低LDH的活力，除治療組D外，SIP治療組LDH活力得到顯著(p＜0.05)改善，與空白組無顯著(p＞0.05)差異。

圖5 睪丸中γ－GT活力Fig.5 Activity of γ－GT in testis

圖6 睪丸中LDH活力Fig.6 Activity of LDH in testis

3 結論與討論

眾所周知，多糖活性功能與結構，包括分子量的大小、所含的官能團等是密切相關的。近年來，關于SIP的結構與功能有一系列研究，其結構證實［5］由等摩爾質量的三種單糖組成的重復單元，三種單糖分別是 N－乙酰半乳糖、巖藻糖、葡糖醛酸，結構式［－3－GlcAβ－1，4－(GalNacα－1，3－)Fucα1－］n，與本研究紅外掃描圖譜相符合。

SIP具有多種生物活性功能，本研究結果表明SIP能緩解CP導致的睪丸損傷，確證了我們先前的結論［6］。CP導致睪丸重量的減輕與精子形成過程及睪丸組織損傷有關［7］。LDH位于成熟或正在成熟睪丸生精細胞線粒體膜內，在質子轉移的過程中起到至關重要的作用。CP降低LDH酶活力，影響精子的發(fā)生及成熟［8］。γ－GT活性與睪丸支持細胞的成熟與增殖有關，其活性的升高是由于睪丸組織受到損傷［9］。SIP對CP導致的LDH活力的降低、γ－GT活性升高有緩解作用，這可能與SIP分子量及所含硫酸根有關。本研究測得分離純化SIP的重均分子量為37ku左右，硫酸根含量為3%，具有對睪丸損傷的保護作用。其保護作用效果及相關機制與分子大小及組成是否有關有待進一步研究。

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