HPLC法測定格列齊特緩釋膠囊的含量和有關物質

許煜靜，張慶偉，彭秋燕，李翔宇，郝 旖，楊金榮

（天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

格列齊特為第二代磺酰脲類口服降糖藥，主要作用于胰島β細胞，能顯著地降低血糖水平,恢復胰島素生理性的分泌模式，并通過提高胰島素對靶組織的敏感性，改善胰島素抵抗[1-3]。緩釋微丸膠囊是一種新劑型，屬劑量分散型劑型,與單劑量劑型相比，能夠迅速分布于整個胃腸道，使生物利用度提高并減小局部刺激，提高患者服藥的依從性[4]。中國藥典2010年版二部收錄了格列齊特片（規(guī)格為80 mg/片）的質量標準，未收錄格列齊特緩釋制劑。本文參考中國藥典2010年版二部格列齊特片的含量測定和有關物質測定方法[5]，色譜條件優(yōu)化后應用于格列齊特緩釋膠囊含量和有關物質的測定，結果表明該方法專屬性強，結果準確可靠，可有效控制藥品質量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters公司2487雙波長紫外檢測器高效液相色譜儀，色譜柱Eclipse XDB-C8（4.6×150 mm，5 μm，Agilent公司）。

1.1.2 試藥 格列齊特原料藥（寧波利民康藥業(yè)有限公司，批號201101），格列齊特對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號201004），1-（3-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛基）-3-鄰甲苯磺酰脲（格列齊特雜質Ⅰ，中國食品藥品檢定研究院，批號201101），格列齊特緩釋膠囊（3批，自制，批號 20120401，21020404，20120406），乙腈、三氟乙酸（色譜純，J&K Scientific LTD），三乙胺（分析純，J&K Scientific LTD）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱E－clipse XDB-C8（4.6×150 mm，5 μm），柱溫 35 ℃，流動相乙腈-水-三乙胺-三氟乙酸（39∶61∶0.1∶0.1），流速 1.0 mL·min-1，進樣量 20 μL，檢測波長 235 nm。分別精密量取格列齊特供試品和格列齊特雜質Ⅰ對照品適量，用40%乙腈溶液配制成含格列齊特0.2 μg·mL-1和格列齊特雜質Ⅰ0.3 μg·mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適應性試驗溶液。取該溶液20 μL進樣，在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按格列齊特主峰計算不低于3000，格列齊特色譜峰與格列齊特雜質Ⅰ色譜峰的分離度應符合要求。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 供試品溶液Ⅰ：取本品內容物研細，精密稱取粉末適量（約相當于格列齊特100 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超聲溶解15 min，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液Ⅰ。

1.2.2.2 自身對照溶液：精密量取供試品溶液Ⅰ2mL，置100mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，在40%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液。

1.2.2.3 供試品溶液Ⅱ：精密量取供試品溶液Ⅰ5mL，置25mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液Ⅱ。

1.2.2.4 對照品溶液：精密稱取格列齊特對照品約20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超聲溶解后，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.2.3 專屬性考察

1.2.3.1 空白輔料干擾試驗：稱取格列齊特緩釋膠囊全輔料適量，照1.2.2.1項下方法配制，在上述色譜條件下進樣20 μL，記錄色譜圖。另分別精密量取供試品溶液Ⅱ和對照品溶液進樣，記錄色譜圖。

1.2.3.2 破壞性試驗：（1）酸破壞：稱取相當于格列齊特100 mg的供試品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.01 mol·L-1的鹽酸10 mL，在80℃水浴中加熱30 min后，冷卻，酸破壞溶液用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調至中性。（2）堿破壞：稱取相當于格列齊特100 mg的供試品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液10 mL，在100℃水浴中60 min后，冷卻，用0.1 mol·L-1的鹽酸調節(jié)至中性。（3）氧化破壞：稱取相當于格列齊特100 mg的供試品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.3%的雙氧水10 mL后，在80℃水浴中30 min后，冷卻。

上述酸、堿、氧化破壞溶液，照1.2.2.1項下“加乙腈40 mL……”起，制備供試溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.4 線性關系和范圍 精密稱取格列齊特對照品100.0 mg，同1.2.2.4項下配制方法，配制成1.00 mg·mL-1儲備液。精密量取對照品溶液儲備液2.0、3.5、5.0、6.5和8.0 mL用40%乙腈溶液稀釋至25 mL，搖勻，在上述色譜條件下進樣20 μL，測定峰面積，繪制標準曲線。

1.2.5 精密度 取濃度約為200 μg·mL-1的供試品溶液連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測定精密度。

1.2.6 回收率測定 分別精密稱取格列齊特80、100和120 mg，置100 mL量瓶中，用40 mL乙腈超聲溶解，再分別加入相當于100 mg處方量的輔料粉末，加水稀釋至刻度，搖勻。分別移取5 mL，置25 mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻。過濾后分別進樣20 μL，記錄峰面積，計算回收率。

1.2.7 穩(wěn)定性考察

1.2.7.1 含量測定穩(wěn)定性考察：取供試品溶液Ⅱ，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8、24h 時進樣，記錄色譜圖。

1.2.7.2 有關物質穩(wěn)定性考察：取供試品溶液Ⅰ，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8、24h 時進樣，記錄色譜圖。

1.2.8 檢測限 取自身對照溶液作為儲備液，逐步稀釋，在上述色譜條件進樣20 μL，測定檢測限。

1.2.9 含量測定 取樣品3批，照1.2.2.3項下方法制備，并取對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣20 μL，測定峰面積。用外標法計算含量。本品含格列齊特應為標示量的93%~107%[5]。

1.2.10 有關物質測定 取樣品3批，照1.2.2項下供試品溶液Ⅰ和自身對照溶液配制方法制備，分別進樣20 μL，以外標峰面積不加校正因子主成分自身對照法計算有關物質相對含量。單個雜質峰面積不得大于自身對照溶液主峰面積，各雜質峰面積的和不得大于自身對照溶液主峰面積的2倍[5]。

2 結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 系統(tǒng)適用性試驗結果表明，在1.2.1項色譜條件下，格列齊特色譜峰與格列齊特雜質Ⅰ色譜峰的分離度為1.98。見圖1。

2.2 專屬性考察

2.2.1 空白輔料干擾試驗 結果表明，空白輔料不干擾格列齊特的測定。見圖2。

2.2.2 破壞性試驗 樣品溶液的酸、堿、氧化破壞色譜圖與未破壞圖比較，結果顯示，各條件下的降解產物和本品主峰均能達到完全分離。

圖1 系統(tǒng)適用性實驗（1格列齊特，2格列齊特雜質Ⅰ）

圖2 空白輔料干擾試驗結果（1格列齊特）

圖3 破壞性試驗結果（1格列齊特）

2.3 線性關系和范圍 以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=44846x+134539，相關系數(shù)r=0.9998，結果表明格列齊特在80.08~320.32 μg·mL-1濃度范圍內，線性關系良好。

2.4 精密度 精密度考察結果的RSD值為0.10%（n=6），表明精密度良好。

2.5 回收率 格列齊特的回收率為100.37%，RSD為0.54%，符合方法學要求。見表1。

2.6 穩(wěn)定性

2.6.1 含量測定穩(wěn)定性 格列齊特峰面積RSD值為1.01%，表明格列齊特在24 h內穩(wěn)定。

2.6.2 有關物質穩(wěn)定性 結果顯示總雜質峰面積在0~6 h內RSD<2%，6 h后RSD>2%，因此在有關物質檢查時樣品溶液應臨用現(xiàn)配，不能超過6 h。

表1 含量測定的回收率考察結果

2.7 檢測限 經過多次稀釋，格列齊特的檢出限為8.76 ng。

2.7 樣品含量測定和有關物質測定 樣品含量和有關物質測定結果見表2。

表2 格列齊特含量和有關物質測定結果

3 討論

3.1 有關物質測定的方法學研究中，總雜質在6 h內基本穩(wěn)定，雜質峰以格列齊特雜質Ⅰ變化最為明顯，但6 h內均未超過0.2%的限量，可以認為基本穩(wěn)定。因此采用本方法測定格列齊特緩釋膠囊的有關物質時，樣品溶液需臨用現(xiàn)配。

3.2 在酸、堿、氧化破壞實驗過程中發(fā)現(xiàn)格列齊特經過同樣濃度酸、堿破壞后，在堿性溶液中較穩(wěn)定，在酸性溶液中不穩(wěn)定，主成分峰減小太多；氧化條件劇烈時，主峰甚至消失，失去破壞性試驗意義，提示本品易氧化分解。本文調整鹽酸的濃度至0.01 mol·L-1和雙氧水濃度至0.3%時，使其適度降解（10%～20%），主峰與降解物或降解物間分離度良好；通過試驗發(fā)現(xiàn)加熱破壞的程度遠遠小于酸、堿、氧化破壞的程度。

［1］吳德云，陳明衛(wèi).格列齊特緩釋片對胰島素抵抗和胰島β細胞功能的影響[J].實用糖尿病雜志，2009，1（2）:37

［2］丁平，查偉.格列齊特緩釋片治療2型糖尿病的臨床研究近況[J].實用中西醫(yī)結合臨床，2007,7（5）:92

［3］蘇紅麗.格列齊特緩釋片治療老年2型糖尿病的療效與安全性觀察[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2012,6（2）:48

［4］張蓉，方瑜，曹德英.格列齊特緩釋微丸膠囊的制備及體外釋放度考察[J].制劑技術，2006,15（10）:27

［5］國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:810-811