HGF蛋白在前列腺癌患者腫瘤組織及血漿中的表達(dá)

王 勇，馮香梅，喬嶺梅，岳 丹

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津300203；3.中國人民解放軍第二五四醫(yī)院，天津300142）

在我國，近年隨著人均壽命的延長，膳食結(jié)構(gòu)的改變和診斷技術(shù)的提高，前列腺癌（prostate cancer，PC）發(fā)病率有明顯增高的趨勢。肝細(xì)胞生長因子（hepatocytegrowth factor，HGF）是由間質(zhì)細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，通過自分泌或旁分泌的形式作用于數(shù)種上皮源性細(xì)胞。通過作用于細(xì)胞膜表面的特異性跨膜受體c-MET蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用，具有強(qiáng)促分裂、組織形成、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移、侵襲、誘導(dǎo)血管形成以及抑制細(xì)胞凋亡等作用[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤患者的腫瘤組織及血漿中HGF的濃度與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[2-5]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察前列腺癌患者組織標(biāo)本及血漿中HGF表達(dá)情況，為前列腺癌的診治提供新的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2011年手術(shù)或穿刺活檢的前列腺癌38例和良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）組織標(biāo)本 30例。病人年齡58～82歲?；颊咄ㄟ^術(shù)后或穿刺活檢標(biāo)本病理確診為前列腺癌，通過肛診、骨掃描、CT、MRI及彩超來輔助進(jìn)行前列腺癌的臨床分期。前列腺癌病理類型為前列腺腺癌；良性前列腺增生作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 兔抗人HGF多克隆抗體（Abcam），β-actin抗體（Santa Cruz），SP染色試劑盒（福州邁新生物），HGF（h）ELISA試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德），RM2135組織切片機(jī)（LEICA），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），酶標(biāo)儀 550（Bio-Rad）。

1.2.2 免疫組化 采用鏈霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫組化法（streptavidin-peroxidase conjugated method，SP法），標(biāo)本石蠟切片，HGF一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)各標(biāo)記物的反應(yīng)強(qiáng)度按陽性細(xì)胞所占細(xì)胞數(shù)量百分比與陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。兩者分值相加最后得分：0～3分為陰性（-），3.5～6分為陽性（+），6.5～8分為強(qiáng)陽性（++）。見表 1。

表1 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab1 Thestandard of immunohistochem istry score

1.2.3 ELISA 按照說明書配制檢測所需的標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測血清，反應(yīng)后棄去板內(nèi)液體，加入生物素抗人HGF抗體工作液，37℃反應(yīng)60min，反復(fù)洗滌后加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物（avidin-peroxidase complex，ABC）工作液，反應(yīng)后再次洗滌，先后加入TMB顯色液及終止液，使用酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值，建立曲線，計(jì)算HGF濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體分析統(tǒng)計(jì)方法見結(jié)果，以P<0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌及前列腺增生組織中HGF的表達(dá) 前列腺增生及前列腺癌組織中HGF染色集中在間質(zhì)的成纖維細(xì)胞及其周圍，癌細(xì)胞中少量表達(dá)（圖1）。前列腺增生及前列腺癌組織中HGF表達(dá)陽性率分別為43.33%（30例有13例表達(dá)）及78.95%（38例有30例表達(dá)），統(tǒng)計(jì)分析顯示二者之間差異具有高度顯著性（P<0.01）。HGF的表達(dá)與前列腺癌Gleason評(píng)分及T分期有關(guān)，Gleason評(píng)分大于7的癌組織中HGF表達(dá)高于Gleason評(píng)分小于7的癌組織（P<0.05）；與T1/T2期腫瘤相比較，T3/T4期腫瘤中HGF表達(dá)增高，差異具有顯著性（P<0.05）；本實(shí)驗(yàn)中PSA≤10 ng/mL與＞10 ng/mL的患者之間及年齡≤70歲與＞70歲的前列腺癌患者之間相比較，癌組織中HGF表達(dá)差異無顯著性（P>0.05），見表2。

表2 前列腺癌組織中HGF的表達(dá)與各項(xiàng)臨床參數(shù)的關(guān)系Tab2 Comparison ofHGF exp ression in the tissuesaccording to different patient characteristic

2.2 前列腺癌及前列腺增生患者血漿中HGF濃度 前列腺癌患者血漿中HGF濃度明顯高于前列腺增生患者血漿中HGF濃度，二者比較差異具有高度顯著性（P<0.01）；與HGF在組織中表達(dá)相對(duì)應(yīng)，患者血漿中的HGF濃度與前列腺癌Gleason評(píng)分及臨床分期有關(guān)；Gleason評(píng)分＞7及Gleason評(píng)分≤7的患者血漿中HGF濃度比較差異有顯著性（P<0.05）；與腫瘤局限于前列腺內(nèi)的患者相比，腫瘤突破包膜的患者血漿中HGF水平升高，差異有顯著性（P<0.05）；前列腺癌患者的PSA水平及年齡不影響血漿中HGF的水平，見表3。

表3 前列腺癌患者血漿中HGF濃度與各項(xiàng)臨床參數(shù)的關(guān)系Tab3 Comparison of HGF level in the serum according to different patient characteristic

2.3 HGF在前列腺癌組織及血漿表達(dá)的相關(guān)性分析 應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析證實(shí)HGF在前列腺癌組織及血漿表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.49，P=0.025）。

3 討論

本研究通過對(duì)前列腺增生及前列腺癌患者組織及血漿中的HGF表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF表達(dá)明顯高于前列腺增生患者，HGF表達(dá)與前列腺癌臨床分期和Gleason評(píng)分相關(guān)。

前列腺癌是一種極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。我國前列腺癌的發(fā)病率雖明顯低于歐美國家，但近年來有增高的趨勢。前列腺癌發(fā)病隱匿，很多患者就診時(shí)即有淋巴結(jié)或骨轉(zhuǎn)移，前列腺癌根治術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，治療過程中進(jìn)展為激素非依賴性前列腺癌，這都是目前前列腺癌的治療效果較差的原因。因此明確前列腺癌發(fā)生及進(jìn)展的機(jī)制，尋找新的診斷及治療靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)之急。

HGF是由間質(zhì)細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，通過自分泌或旁分泌的形式作用于數(shù)種上皮源性細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。通過作用于細(xì)胞膜表面的特異性跨膜受體c-MET蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用，具有強(qiáng)促分裂、組織形成、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移、侵襲、誘導(dǎo)血管形成以及抑制細(xì)胞凋亡等作用[1]。與前列腺增生患者相比，前列腺癌患者血液中HGF濃度升高，腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者術(shù)后復(fù)發(fā)后，患者血液中HGF會(huì)進(jìn)一步增高[6-7]。本研究同時(shí)對(duì)前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF明顯高于前列腺增生患者，且與前列腺癌臨床分期和Gleason評(píng)分相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織及血漿中HGF的表達(dá)呈正相關(guān)，因此我們認(rèn)為組織及血漿中的HGF可能成為前列腺癌篩查及預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物。

Tsuka[8]研究組認(rèn)為前列腺癌可能通過自分泌和旁分泌的形式來調(diào)節(jié)HGF的合成，這是前列腺癌患者血漿中HGF升高的重要原因。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)前列腺癌可以通過旁分泌的方式分泌一些因子來刺激間質(zhì)的成纖維細(xì)胞分泌HGF，但是前列腺癌中HGF合成的自分泌調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。Nakashiro[9-10]研究組發(fā)現(xiàn)前列腺基質(zhì)細(xì)胞分泌HGF，作為旁分泌生長因子刺激激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞生長，促進(jìn)激素依賴性前列腺癌發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。本研究中免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)HGF染色主要位于前列腺癌間質(zhì)的成纖維細(xì)胞漿中及其周圍，癌細(xì)胞中只有少量表達(dá)，因此認(rèn)為前列腺癌中HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞分泌，而后可能作用于癌細(xì)胞，發(fā)揮其生物學(xué)作用。我們在既往的研究中也發(fā)現(xiàn)NK4可以抑制HGF誘導(dǎo)的c-Met及其下游的ERK和Akt1/2蛋白的活化，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]。HGF/c-Met可以作為前列腺癌治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)前列腺癌患者HGF表達(dá)明顯高于前列腺增生患者，且與前列腺癌臨床分期和Gleason評(píng)分相關(guān)，HGF可能是前列腺癌診療的潛在的靶點(diǎn)。

[1]Matsumoto K,Nakamura T.NK4 gene therapy targeting HGF-Met and angiogenesis[J].FrontBiosci,2008,13:1943

[2]Han SU,Lee JH,Kim W H,etal.Significant correlation between serum level of hepatocyte growth factor and progression of gastric carcinoma[J].World JSurg,1999,23（11）:1176

[3]UjiieH,TomidaM,Akiyama H,etal.Serum hepatocytegrowth factorand interleukin-6 areeffective prognosticmarkers for non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2012,32（8）:3251

[4]Ahmed H H,Metwally F M,Mahdy E S,etal.Clinical value of serum hepatocyte growth factor,B-cell lymphoma-2 and nitric ox ide in primarybreastcancer patients[J].EurRevMed PharmacolSci,2012,16（7）:958

[5]Jung K H,Park BH,Hong SS.Progress in cancer therapy targeting c-Metsignalingpathway[J].Arch Pharm Res,2012,35（4）:595

[6]Gupta A,Karakiewicz P I,Roehrborn CG,etal.Predictive value of plasmahepatocytegrowth factor/scatter factor levels in patientswith clinically localized prostate cancer[J].Clin Cancer Res,2008,14（22）:7385

[7]Yasuda K,Nagakawa O,Akashi T,etal.Serum active hepatocyte growth factor（AHGF）in benign prostatic diseaseand prostate cancer[J].Prostate,2009,69（4）:346

[8]Tsuka H,MoriM H,Li B,etal.Enhanced hepatocytegrowth factor levelin human prostate cancer treated with endocrine therapy[J].Int JOncol,1998,13（1）:169

[9]Nakashiro K,Hara S,Shinohara Y,etal.Phenotypic switch from paracrine to autocrine role of hepatocyte growth factor in an androgen-independenthuman prostatic carcinoma cell line,CWR22R[J].Am JPathol,2004,165（2）:533

[10]Nakashiro K,OkamotoM,HayashiY,etal.Hepatocytegrowth factor secreted by prostate-derived stromal cells stimulates growth of androgen-inde pendenthu manprostatic carcinomacells[J].Am JPathol,2000,157（3）:795

[11]Yue D,Wang Y,Ma P,etal.Effects of transferred NK4 gene on proliferation,migration,invasion and apoptosis of human prostate cancer DU145 cells[J].Asian JAndrol,2010,12（3）:381