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    HPLC法測(cè)定壯骨止痛顆粒中延胡索乙素的含量

    2013-10-22 02:37:58謝憲斌王巨存

    謝憲斌,王巨存

    (1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300070;2.天津市天津醫(yī)院藥劑科,天津 300211)

    壯骨止痛顆粒是天津醫(yī)院應(yīng)用多年的中藥制劑,由淫羊藿、蛇床子、延胡索組成,具補(bǔ)腎壯骨、活血止痛功能,用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老年性骨質(zhì)疏松癥的治療。方中延胡索所含延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛作用[1]。為有效控制該制劑質(zhì)量,在前期工作的基礎(chǔ)上[2],本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)延胡索乙素進(jìn)行定量分析。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    1.1.1 儀器 W1aters高效液相色譜儀(515HPLC泵、486紫外檢測(cè)器、Millennium2010色譜工作站,美國);UV-240紫外分光光度計(jì)(日本島津);AUW120電子分析天平(日本島津);TCQ250型超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

    1.1.2 試劑 延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào):110726-201112)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純,水為注射用水,其余試劑均為分析純。壯骨止痛顆粒樣品(批號(hào) 120302,120517,120720,規(guī)格:10 g/袋;由天津醫(yī)院制備)。

    1.2 方法

    1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取延胡索乙素對(duì)照品甲醇溶液在190~400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,結(jié)果溶液在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

    1.2.2 色譜條件 色譜柱:Symmetry C18(150mm×3.9mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(34∶66)(三乙胺調(diào) pH 值至 6.5);流速為 0.8mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;柱溫:25℃。進(jìn)樣量:20μL。在該色譜條件下進(jìn)行試驗(yàn),主峰應(yīng)與其它峰分離度大于1.5,理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

    1.2.3 提取條件的選擇

    1.2.3.1 提取溶劑:取同一批號(hào)(120302)樣品,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇或堿性甲醇(濃氨試液-甲醇比例1:20)50mL,稱定重量,超聲(250W,40 KHz)提取 60min,放冷,再稱定各自重量,用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測(cè)定樣品中延胡索乙素的含量(n=3)。甲醇提取結(jié)果為0.019 2mg/g,堿性甲醇提取結(jié)果為0.019 5mg/g。兩種溶劑對(duì)延胡索乙素的提取無明顯影響(RSD=1.10%)。

    1.2.3.2 提取方式:取同一批號(hào)(120302)樣品,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,稱定重量,分別采用超聲處理與加熱回流的方式,提取60min,放冷,再稱定各自重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測(cè)定樣品中延胡索乙素的含量(n=3)。超聲提取結(jié)果為0.019 4mg/g,回流提取結(jié)果為0.019 8mg/g,兩種方式對(duì)延胡索乙素的提取無明顯影響(RSD=1.44%)。

    1.2.3.3 提取時(shí)間:取同一批號(hào)(120302)樣品,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇 50mL,稱定重量,分別超聲處理 30、60、90min,放冷,再稱定各自重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測(cè)定樣品中延胡索乙素含量(n=3)。30min提取結(jié)果為0.0183mg/g,60min提取結(jié)果為0.0191mg/g,90min提取結(jié)果為0.019 5mg/g。30與60min測(cè)定結(jié)果的RSD為3.02%,60與90 min測(cè)定結(jié)果的RSD為1.46%。故超聲提取60min較為適宜。

    1.2.3.4 提取溶劑用量:取同一批號(hào)(120302)樣品,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇30mL或50mL,稱定重量,超聲處理60min,放冷,再稱定各自重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測(cè)定樣品中延胡索乙素的含量(n=3)。30mL提取結(jié)果為0.017 6mg/g,50mL提取結(jié)果為0.019 2 mg/g,30mL與50mL測(cè)定結(jié)果的RSD為6.15%。因此,以甲醇50mL為提取溶媒。

    1.2.4 溶液的制備

    1.2.4.1 對(duì)照品溶液:取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的延胡索乙素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含10μg的溶液,即得。

    1.2.4.2 供試品溶液:取樣品適量,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,稱定重量,超聲處理1 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    1.2.4.3 陰性對(duì)照溶液:取缺延胡索的陰性樣品,按“1.2.4.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

    1.2.5 方法專屬性 在上述色譜條件下,分別取延胡索乙素對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL,注入色譜儀。供試品色譜圖中,在與延胡索乙素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,有一相同保留時(shí)間的色譜峰。而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間處無干擾,見圖1。

    1.2.6 線性關(guān)系考察 取延胡索乙素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成0.04mg/mL的溶液,作為儲(chǔ)備液,再分別稀釋成濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的對(duì)照品溶液,分別精密吸取上述5種濃度的對(duì)照品溶液各20μL,注入液相色譜儀,按“1.2.1”色譜條件分析,測(cè)定各自峰高,以對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰高值為縱坐標(biāo),求得回歸方程:Y=6.981×105X+1.376×103,r=0.999 6。結(jié)果表明延胡索乙素在0.005~0.025mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

    1.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定延胡索乙素峰高,RSD為1.32%,表明儀器精密度良好。

    1.2.8 穩(wěn)定性考察 取同一對(duì)照品溶液,分別于0、4、8、24、48、72 h 進(jìn)樣,測(cè)定峰高值,RSD 為 1.38%,表明對(duì)照品在72 h穩(wěn)定性良好。取同一供試品溶液,分別于 0、4、8、24、48、72 h 進(jìn)樣,測(cè)定峰高值,RSD為1.52%,表明供試品在72 h穩(wěn)定性良好。

    1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品,共6份,研細(xì),取約5 g,按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作,測(cè)定每份樣品中延胡索乙素含量,RSD為1.65%,表明重復(fù)性良好。

    1.2.10 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品,研細(xì),取約5 g,共6份,精密稱定,分別加入延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.04mg/mL)2.35mL,再按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作,制得供回收率用供試品溶液,按“1.2.2”色譜條件分析,計(jì)算回收率見表1。

    表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab1 Resultof samp le recovery tests(n=6)

    2 結(jié)果

    取3個(gè)批號(hào)的樣品,按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作,按“1.2.2”色譜條件測(cè)定樣品中延胡索乙素含量。結(jié)果見表2。

    表2 3批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab2 Content determ ination resultsof samp les(n=3)

    3 討論

    3.1 色譜柱的選擇 試驗(yàn)中選擇了3種不同色譜柱,并以甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.5)(55∶45)[3]和乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào) pH值至 6.5)(35∶65)[4]為流動(dòng)相,結(jié)果表明延胡索乙素在 Thermo BetaBasic-18(250mm×4.6mm,5μm)、Elite YWGC18(250mm×4.6mm,10μm)均嚴(yán)重拖尾(文獻(xiàn)也有類似報(bào)道[5-9]),改變流動(dòng)相的比例和pH均無變化,換用Waters Symmetry C18(150mm×3.9 mm,5μm)后得到了理想的峰形。延胡索乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有淑氮原子,可能與C18柱的殘余硅羥基產(chǎn)生相互作用從而產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。YWGC18未經(jīng)端基封尾,Thermo BetaBasic-18和 Waters Symmetry C18都經(jīng)過端基封尾,但前者仍產(chǎn)生拖尾,這可能與其它的填料參數(shù)有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果提示,上述兩種流動(dòng)相適合分離延胡索乙素,但要選擇合適的色譜柱。

    3.2 流動(dòng)相的選擇 延胡索乙素的HPLC分析以甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(60∶40)和乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(35∶65)為流動(dòng)相較為有代表性。本試驗(yàn)結(jié)果表明,前者柱壓較高,后者柱壓較低,故選后者,但35∶65的比例陰性對(duì)照有干擾,改為34∶66后則消除了陰性對(duì)照的干擾。此外,若0.1%磷酸溶液換成純水,則延胡索乙素的峰形很差,提示0.1%磷酸溶液是必需的。

    3.3 流動(dòng)相pH的選擇 試驗(yàn)中選擇了3種不同pH值,分別是5.5、6.0、6.5,在這3種pH下,延胡索乙素的峰形都較好,但pH5.5導(dǎo)致出峰時(shí)間前移較多(9.8分)影響樣品分離。在本試驗(yàn)條件下,pH6.5的峰形較pH6.0更好,故pH選擇6.5。

    3.4 提取條件的選擇 甲醇、堿性甲醇對(duì)延胡索乙素的提取無明顯差異(RSD=1.10%),其原因可能與該制劑中各味藥材經(jīng)水提而非藥材粉末有關(guān),但甲醇比堿性甲醇使用更方便,故本方法采用甲醇為提取溶媒;回流提取與超聲提取對(duì)測(cè)定結(jié)果無明顯影響(RSD=1.44%),但后者較為簡(jiǎn)便,故采用超聲提?。辉谔崛r(shí)間方面,60min的測(cè)定結(jié)果高于30min(RSD=3.02%),但60min與90min差異不明顯(RSD=1.46%),故提取時(shí)間確定為60min;在提取溶劑用量方面,50mL的測(cè)定結(jié)果高于30mL(RSD=6.15%),故提取溶劑用量確定為50mL。

    綜上,在文獻(xiàn)方法[4]的基礎(chǔ)上對(duì)色譜柱進(jìn)行了選擇,對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行了調(diào)整,新的色譜方法專屬性強(qiáng)。經(jīng)過對(duì)提取條件較為詳盡的考察,發(fā)現(xiàn)所確定條件操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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