HPLC法測定壯骨止痛顆粒中延胡索乙素的含量

謝憲斌，王巨存

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津市天津醫(yī)院藥劑科，天津 300211）

壯骨止痛顆粒是天津醫(yī)院應用多年的中藥制劑，由淫羊藿、蛇床子、延胡索組成，具補腎壯骨、活血止痛功能，用于絕經(jīng)后骨質疏松癥和老年性骨質疏松癥的治療。方中延胡索所含延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛作用[1]。為有效控制該制劑質量，在前期工作的基礎上[2]，本試驗采用高效液相色譜法對延胡索乙素進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 W1aters高效液相色譜儀（515HPLC泵、486紫外檢測器、Millennium2010色譜工作站，美國）；UV-240紫外分光光度計（日本島津）；AUW120電子分析天平（日本島津）；TCQ250型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設備二廠）。

1.1.2 試劑 延胡索乙素對照品（批號：110726-201112）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為注射用水，其余試劑均為分析純。壯骨止痛顆粒樣品（批號 120302，120517，120720，規(guī)格：10 g/袋；由天津醫(yī)院制備）。

1.2 方法

1.2.1 檢測波長的選擇 取延胡索乙素對照品甲醇溶液在190～400 nm的波長范圍內掃描，結果溶液在280 nm波長處有最大吸收,故確定檢測波長為280 nm。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Symmetry C18（150mm×3.9mm，5μm）；流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液（34∶66）（三乙胺調 pH 值至 6.5）；流速為 0.8mL·min-1；檢測波長為280 nm；柱溫：25℃。進樣量：20μL。在該色譜條件下進行試驗，主峰應與其它峰分離度大于1.5,理論板數(shù)按延胡索乙素峰計算應不低于3 000。

1.2.3 提取條件的選擇

1.2.3.1 提取溶劑：取同一批號（120302）樣品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇或堿性甲醇（濃氨試液-甲醇比例1:20）50mL,稱定重量，超聲（250W,40 KHz）提取 60min，放冷，再稱定各自重量，用相應溶劑補足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定樣品中延胡索乙素的含量（n=3）。甲醇提取結果為0.019 2mg/g，堿性甲醇提取結果為0.019 5mg/g。兩種溶劑對延胡索乙素的提取無明顯影響（RSD=1.10%）。

1.2.3.2 提取方式：取同一批號(120302)樣品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，分別采用超聲處理與加熱回流的方式，提取60min，放冷，再稱定各自重量，用甲醇補足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定樣品中延胡索乙素的含量（n=3）。超聲提取結果為0.019 4mg/g，回流提取結果為0.019 8mg/g，兩種方式對延胡索乙素的提取無明顯影響（RSD=1.44%）。

1.2.3.3 提取時間：取同一批號（120302）樣品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 50mL，稱定重量，分別超聲處理 30、60、90min，放冷，再稱定各自重量，用甲醇補足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定樣品中延胡索乙素含量（n=3）。30min提取結果為0.0183mg/g，60min提取結果為0.0191mg/g，90min提取結果為0.019 5mg/g。30與60min測定結果的RSD為3.02%，60與90 min測定結果的RSD為1.46%。故超聲提取60min較為適宜。

1.2.3.4 提取溶劑用量：取同一批號(120302)樣品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30mL或50mL，稱定重量，超聲處理60min，放冷，再稱定各自重量，用甲醇補足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定樣品中延胡索乙素的含量（n=3）。30mL提取結果為0.017 6mg/g，50mL提取結果為0.019 2 mg/g，30mL與50mL測定結果的RSD為6.15%。因此，以甲醇50mL為提取溶媒。

1.2.4 溶液的制備

1.2.4.1 對照品溶液：取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得。

1.2.4.2 供試品溶液：取樣品適量，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4.3 陰性對照溶液：取缺延胡索的陰性樣品，按“1.2.4.2”項下方法制成陰性對照溶液。

1.2.5 方法專屬性 在上述色譜條件下，分別取延胡索乙素對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20μL，注入色譜儀。供試品色譜圖中，在與延胡索乙素對照品色譜相應的位置上，有一相同保留時間的色譜峰。而陰性對照溶液在此保留時間處無干擾，見圖1。

1.2.6 線性關系考察 取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.04mg/mL的溶液，作為儲備液，再分別稀釋成濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的對照品溶液，分別精密吸取上述5種濃度的對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按“1.2.1”色譜條件分析，測定各自峰高，以對照品濃度（mg/mL）為橫坐標，峰高值為縱坐標，求得回歸方程：Y=6.981×105X+1.376×103，r=0.999 6。結果表明延胡索乙素在0.005～0.025mg/mL范圍內線性良好。

1.2.7 精密度試驗 取同一對照品溶液重復進樣5次，測定延胡索乙素峰高，RSD為1.32%，表明儀器精密度良好。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 取同一對照品溶液，分別于0、4、8、24、48、72 h 進樣，測定峰高值，RSD 為 1.38%，表明對照品在72 h穩(wěn)定性良好。取同一供試品溶液，分別于 0、4、8、24、48、72 h 進樣，測定峰高值，RSD為1.52%，表明供試品在72 h穩(wěn)定性良好。

1.2.9 重復性試驗 取同一批號樣品，共6份，研細，取約5 g，按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作，測定每份樣品中延胡索乙素含量，RSD為1.65%，表明重復性良好。

1.2.10 回收率試驗 取同一批號樣品，研細，取約5 g，共6份，精密稱定，分別加入延胡索乙素標準儲備液（0.04mg/mL）2.35mL，再按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件分析，計算回收率見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）Tab1 Resultof samp le recovery tests（n=6）

2 結果

取3個批號的樣品，按照“1.2.4.2”供試品溶液制備操作，按“1.2.2”色譜條件測定樣品中延胡索乙素含量。結果見表2。

表2 3批樣品測定結果(n=3)Tab2 Content determ ination resultsof samp les（n=3）

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 試驗中選擇了3種不同色譜柱，并以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調pH值至6.5）（55∶45）[3]和乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調 pH值至 6.5）（35∶65）[4]為流動相，結果表明延胡索乙素在 Thermo BetaBasic-18（250mm×4.6mm，5μm）、Elite YWGC18（250mm×4.6mm，10μm）均嚴重拖尾（文獻也有類似報道[5-9]），改變流動相的比例和pH均無變化，換用Waters Symmetry C18(150mm×3.9 mm，5μm)后得到了理想的峰形。延胡索乙素的化學結構含有淑氮原子，可能與C18柱的殘余硅羥基產(chǎn)生相互作用從而產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。YWGC18未經(jīng)端基封尾，Thermo BetaBasic-18和 Waters Symmetry C18都經(jīng)過端基封尾，但前者仍產(chǎn)生拖尾，這可能與其它的填料參數(shù)有關。試驗結果提示，上述兩種流動相適合分離延胡索乙素，但要選擇合適的色譜柱。

3.2 流動相的選擇 延胡索乙素的HPLC分析以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調pH值至6.0）（60∶40）和乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調pH值至6.0）（35∶65）為流動相較為有代表性。本試驗結果表明，前者柱壓較高，后者柱壓較低，故選后者，但35∶65的比例陰性對照有干擾，改為34∶66后則消除了陰性對照的干擾。此外，若0.1%磷酸溶液換成純水，則延胡索乙素的峰形很差，提示0.1%磷酸溶液是必需的。

3.3 流動相pH的選擇 試驗中選擇了3種不同pH值，分別是5.5、6.0、6.5，在這3種pH下，延胡索乙素的峰形都較好，但pH5.5導致出峰時間前移較多（9.8分）影響樣品分離。在本試驗條件下，pH6.5的峰形較pH6.0更好，故pH選擇6.5。

3.4 提取條件的選擇 甲醇、堿性甲醇對延胡索乙素的提取無明顯差異（RSD=1.10%），其原因可能與該制劑中各味藥材經(jīng)水提而非藥材粉末有關，但甲醇比堿性甲醇使用更方便，故本方法采用甲醇為提取溶媒；回流提取與超聲提取對測定結果無明顯影響（RSD=1.44%），但后者較為簡便，故采用超聲提??；在提取時間方面，60min的測定結果高于30min（RSD=3.02%），但60min與90min差異不明顯（RSD=1.46%），故提取時間確定為60min；在提取溶劑用量方面，50mL的測定結果高于30mL（RSD=6.15%），故提取溶劑用量確定為50mL。

綜上，在文獻方法[4]的基礎上對色譜柱進行了選擇，對流動相的比例進行了調整，新的色譜方法專屬性強。經(jīng)過對提取條件較為詳盡的考察，發(fā)現(xiàn)所確定條件操作簡便，結果準確可靠。

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