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    IL-17對黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖和侵襲的影響

    2013-10-22 02:37:54馬躍美劉艷榮房東亮
    關(guān)鍵詞:黑色素瘤明膠小鼠

    王 倩 ,馬躍美 ,孫 濤 ,劉艷榮 ,房東亮 ,田 原

    (天津醫(yī)科大學(xué)1.外科手術(shù)學(xué)教研室;2.病理學(xué)教研室,天津300070)

    白細(xì)胞介素-17(IL-17)在炎癥和自身免疫性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用且在多種腫瘤中高表達(dá),但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未定論。目前關(guān)于IL-17對腫瘤細(xì)胞體外增殖作用的影響研究較少。近年來研究證明IL-17可以上調(diào)MMPs、IL-6和IL-8等促侵襲因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲[1-2]。黑色素瘤是一種高侵襲性的惡性腫瘤,腫瘤細(xì)胞本身可以分泌MMP-2和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究在前期研究慢性炎癥與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)上,通過體外實(shí)驗(yàn)探討了IL-17對黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和侵襲的影響,為進(jìn)一步研究IL-17在慢性炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10由天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室凍存。重組鼠IL-17購自美國PeproTech公司,transwell小室(直徑為 8μm)購自Invitrogen公司,MTT購自美國Sigma公司,Matrigel膠購自美國BD公司,細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司,胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10,接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中 (加入青霉素、鏈霉素各100 U/mL),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均選用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

    1.2.2 MTT法檢測B16細(xì)胞的增殖能力 將B16細(xì)胞制備成1×104/mL單細(xì)胞懸液,按每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)液中加入終濃度分別為 5、10、20、50、100 ng/mL 的 IL-17,并設(shè)空白對照組,在培養(yǎng)箱中分別放置24、48、72 h后,加入MTT 100μL培養(yǎng)4 h,吸棄液體,每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶標(biāo)儀于490 nm處測吸光度值(A值),以5復(fù)孔的平均A值為相應(yīng)的A值。

    1.2.3 transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測B16細(xì)胞的侵襲能力 用50mg/LMatrigel膠1∶8稀釋液包被transwell小室的上室面,37℃孵育過夜。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,次日消化重懸細(xì)胞,于下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基、上室中加入無血清和濃度為50 ng/mL IL-17的B16細(xì)胞懸液各200μL,并設(shè)空白對照組,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室,PBS淋洗,擦去上室中細(xì)胞,95%酒精固定10min,4 g/L結(jié)晶紫染色,PBS清洗,200倍倒置顯微鏡下拍照穿膜細(xì)胞,隨機(jī)選10個(gè)視野,計(jì)算平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每組各設(shè)3復(fù)孔。

    1.2.4 明膠酶譜檢測B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)活性 將無血清的B16細(xì)胞接種到24孔板,每孔500μL,培養(yǎng)24 h后,在培養(yǎng)液中加入50 ng/mL IL-17,培養(yǎng)48 h后,收集上清液,12 000 r/min,離心10min,取上清液進(jìn)行明膠酶譜檢測。以含0.1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳至溴酚蘭進(jìn)入陽極緩沖液為止,分離凝膠,2.5%Triton-X100洗膠4次,每次30min。將膠完全浸入明膠酶孵育液(50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/LCaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/L ZnCl2)中,37 ℃孵育 42 h,常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色,脫色液脫色至復(fù)染帶清晰,圖像分析系統(tǒng)測定凝膠中MMPs活性條帶活性水平,應(yīng)用Gel-pro analyzer分析軟件測定條帶平均灰度值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析,多組比較采用方差分析,兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IL-17對B16細(xì)胞增殖能力的影響 不同濃度IL-17作用于B16細(xì)胞24、48和72 h時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,細(xì)胞活力無變化,IL-17對細(xì)胞的增殖無影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

    2.2 IL-17對B16細(xì)胞侵襲能力的影響 50 ng/mL IL-17作用于B16細(xì)胞48 h后,與對照組相比,穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2 和圖 1)。

    2.3 IL-17對B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)活性的影響 明膠酶譜檢測結(jié)果顯示,50 ng/mL IL-17作用于B16細(xì)胞48 h后,可明顯增強(qiáng)細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3和圖 2)。

    表1 IL-17作用不同時(shí)間B16細(xì)胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

    表1 IL-17作用不同時(shí)間B16細(xì)胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

    分組對照組5 ng/mL組10 ng/mL組20 ng/mL組50 ng/mL組100 ng/mL組FP 72 h 0.466±0.042 0.485±0.043 0.449±0.045 0.507±0.007 0.503±0.023 0.487±0.015 2.29 0.08 48 h 0.364±0.039 0.376±0.038 0.358±0.049 0.377±0.035 0.408±0.028 0.364±0.039 1.16 0.36 24 h 0.226±0.018 0.237±0.020 0.219±0.018 0.235±0.017 0.260±0.033 0.236±0.028 1.77 0.16

    表2 IL-17對B16細(xì)胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

    表2 IL-17對B16細(xì)胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

    與對照組相比*P<0.01

    n99組別對照組50 ng/mL組t穿膜細(xì)胞數(shù)8.89±1.45 34.22±1.56*35.61

    表3 IL-17作用下B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

    表3 IL-17作用下B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

    與對照組相比*P<0.01,**P<0.001

    MMP-9 5.26±0.29 28.28±1.51**26.00 MMP-2 7.06±0.62 13.64±2.32*4.75組別對照組實(shí)驗(yàn)組t

    3 討論

    IL-17是一種主要由活化記憶CD4+T細(xì)胞即Th17細(xì)胞分泌的促炎因子。研究表明,Th17細(xì)胞及IL-17與炎癥和自身免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化等多種疾病相關(guān)。目前IL-17對腫瘤的作用尚存在爭論。有研究認(rèn)為,IL-17通過T細(xì)胞依賴的機(jī)制產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[3]。但多數(shù)研究傾向于IL-17的促腫瘤作用。IL-17通過激活I(lǐng)L-6依賴的Stat3信號通路促進(jìn)腫瘤生長[4];IL-17可促進(jìn)人促絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖和侵襲,但其機(jī)制尚未闡明[5];結(jié)腸癌中,IL-17通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞分泌VEGF促進(jìn)腫瘤血管生成,且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]。

    本課題組在前期建立小鼠氣囊卡介苗慢性炎癥模型[7]的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了氣囊卡介苗-黑色素瘤的慢性炎癥-腫瘤復(fù)合模型,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積、重量、明膠酶表達(dá)活性、微血管密度(MVD)及VEGF 5項(xiàng)指標(biāo)與生理鹽水-黑色素瘤對照組相比均升高。進(jìn)一步檢測小鼠血清細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,IL-17較其他細(xì)胞因子明顯升高,筆者推測在此氣囊卡介苗-黑色素瘤模型中IL-17可能對上述5項(xiàng)檢測指標(biāo)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步探討IL-17是否對腫瘤生長有直接作用,筆者在體外用IL-17刺激B16細(xì)胞,結(jié)果顯示IL-17并不直接刺激黑色素瘤細(xì)胞增殖,推測其可能通過誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF進(jìn)而促進(jìn)血管生成來促進(jìn)腫瘤生長。

    本研究transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-17處理后B16細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多,提示IL-17可以促進(jìn)B16細(xì)胞的體外侵襲。MMPs是一類與腫瘤侵襲相關(guān)的鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族,通過降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),破壞基底膜,促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,其生成和活化依賴多種細(xì)胞因子。近年來研究表明MMPs的表達(dá)與IL-17相關(guān)。在銀屑病性關(guān)節(jié)炎中,IL-17可誘導(dǎo)IL-6、IL-8和MMP-3的產(chǎn)生,阻斷IL-17RA抑制它們產(chǎn)生[8];在垂體腺瘤中研究發(fā)現(xiàn),浸潤組腫瘤組織IL-17及IL-17R表達(dá)水平明顯升高且與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)[9];而且IL-17通過激活A(yù)KT依賴的IL-6/JAK2/STAT 3信號途徑上調(diào)肝癌細(xì)胞IL-8、MMP-2、VEGF的表達(dá),促進(jìn)肝癌遷移、侵襲[2]。本研究顯示,IL-17處理B16細(xì)胞后其MMP-2和MMP-9的活性增強(qiáng),提示IL-17可能通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的活性來促進(jìn)B16細(xì)胞的侵襲能力,但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,IL-17對黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖無明顯的刺激作用,但可增強(qiáng)細(xì)胞的體外侵襲能力,可能通過增強(qiáng)MMP-2和MMP-9的活性而發(fā)揮作用,其具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究為探討IL-17在慢性炎癥與腫瘤進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為通過調(diào)控IL-17等炎癥因子的方法抑制黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了新思路。

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