大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-TolC主動(dòng)外排機(jī)制的研究

朱莉麗，劉德夢(mèng)

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津 300211）

大腸埃希菌的主動(dòng)外排作用是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的重要途徑[1]。有研究顯示AcrAB-TolC 外排泵是大腸埃希菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的多重藥物外排泵[2]，底物廣泛，包括抗生素等化學(xué)物質(zhì)。其外排過程需質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力介導(dǎo)，羰基氰氯苯腙（CCCP）屬于質(zhì)子泵抑制劑，通過抑制膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度，使通道蛋白失活，從而抑制細(xì)菌對(duì)藥物的泵出[3]。為了解大腸埃希菌主動(dòng)外排泵AcrAB-TolC 的存在情況，在多重耐藥中所起作用，本研究對(duì)大腸埃希菌臨床株進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，并對(duì)膜融合蛋白（acra）及外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（acrb）編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用質(zhì)子泵抑制劑CCCP 抑制外排泵的活性，觀察CCCP 處理前后大腸埃希菌最低抑菌濃度變化。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 90 株大腸埃希菌分離自2008年7月-2009年7月天津市某三甲醫(yī)院患者送檢標(biāo)本，剔除同一病例相同部位重復(fù)菌株。所有菌株經(jīng)常規(guī)生化鑒定。大腸埃希菌ATCC25922 作為質(zhì)量控制菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923為acra/acrb 基因陰性對(duì)照菌株。

1.2 體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)與CCCP 抑制試驗(yàn) 氨曲南、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星藥敏紙片均購自天津?yàn)I海華康醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司；頭孢曲松、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；泵抑制劑CCCP 購自Sigma 公司。采用K-B紙片法測(cè)定90 株大腸埃希菌臨床株對(duì)6 種抗菌藥物敏感性，藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI2011）判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)耐藥模式分為多重耐藥組、雙藥耐藥組、單藥耐藥組、全敏感組。選取10 株多重耐藥菌株進(jìn)行CCCP 抑制試驗(yàn)，采取微量肉湯稀釋法測(cè)定加泵抑制劑CCCP（終濃度為100μmol/L）[4]前后多重耐藥菌株對(duì)5 種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。

1.3 DNA 提取 采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA。98℃水浴加熱10 min，以12 000 r/min 離心6 min，吸取上清液保存，作為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）模板。用紫外分光光度計(jì)測(cè)A260 和A280 值，計(jì)算核酸純度和濃度。

1.4 外排泵基因acra、acrb 的PCR 擴(kuò)增 采用煮沸法提取的基因組DNA，分別使用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，acra 引物序列F:CCTCAAGTTAGCGGGATTAT；R:ACCGTCCTGCGGGAACTTAA；acrb 引 物 序列F:GTGGGTGATGTTCGGTTG；R:CGTTTTAACCACTTC GTGA。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為567 bp，516 bp。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，DNA 聚合酶系統(tǒng)購自TAKARA 公司。PCR 反應(yīng)總體積為25μL（DNA 聚合酶系統(tǒng)Premix Taq12.5μL，上游引物及下游引物各1μL，DNA 模板2μL，去離子水8.5μL）；基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，退火溫度acra 基因58℃（acrb 基因55℃）30 s，72℃延伸acra 基因30 s(acrb 基因40 s)，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃終末延伸4 min。

1.5 電泳及測(cè)序 在含0.5 mg/L 的溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，使用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物送北京華大科技有限公司進(jìn)行正負(fù)雙向DNA 序列分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 以SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果 90 株大腸埃希菌對(duì)6 種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率由高到低為環(huán)丙沙星67%，左氧氟沙星61%，慶大霉素53%，頭孢噻肟50%，氨曲南20%，阿米卡星10%。耐藥模式以雙藥耐藥30 株（33.3%），多重耐藥26 株（28.9%）為主，單藥22 株（24.4%），全敏感12 株（13.3%）。

2.2 acra、acrb 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果 外排泵基因acra/acrb 以1.4 處引物序列，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。在90株大腸埃希菌中55 株（61.1%）大腸埃希菌臨床株均可見567 bp（acra）及516 bp（acrb）的擴(kuò)增片段。金黃色葡萄球菌ATCC25923 未見此擴(kuò)增片段（圖1，2）。外排泵基因acra、acrb 在4 種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在，在多重耐藥模式中陽性率分別高達(dá)84.6%和80.8%，見表1。

表1 各類菌株中acra/acrb 基因陽性率（%）Tab 1 The positive rates of acra/acrb gene in various strains（%）

對(duì)多重耐藥組及全敏感組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，acra 基因P=0.017，acrb 基因P=0.009，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果 選取大腸埃希菌臨床株246 acra 基因擴(kuò)增產(chǎn)物及臨床株b716 acrb 基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正負(fù)雙向DNA 序列分析，測(cè)序結(jié)果在Gen－Bank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)后證實(shí)：臨床株246，acra 同源性為98%,臨床株b716，acrb 同源性為99%。

2.4 CCCP 抑制試驗(yàn)結(jié)果 10 株多重耐藥的大腸埃希菌臨床株在應(yīng)用CCCP 后，多數(shù)菌株對(duì)5 種抗生素的MIC 均有不同程度的下降，能使絕大多數(shù)菌株恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性，見表2。菌株1034 對(duì)頭孢曲松的MIC 最高下降倍數(shù)達(dá)128 倍，A620、C636、1034 這3 株菌株對(duì)5 種抗生素均由耐藥變?yōu)槊舾小?/p>

表2 加入CCCP 前后10 株多重耐藥大腸埃希菌MIC 的改變Tab 2 MICs of 10 Escherichia coli isolates with and without CCCP

3 討論

在抗生素的選擇壓力下,細(xì)菌幾乎對(duì)所有臨床使用的抗生素都可能產(chǎn)生耐藥性。本研究所試90株大腸埃希菌對(duì)6 種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，環(huán)丙沙星耐藥率最高為67%，其次為左氧氟沙星61%，阿米卡星最低為10%。上述結(jié)果與2009年中國CHINET 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果基本相近[5]。究其原因，與氟喹諾酮類抗菌藥物的大量應(yīng)用有關(guān)，而使用較少的阿米卡星、氨曲南則對(duì)大腸埃希菌的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)。從耐藥模式分布來看，雙藥耐藥、多重耐藥菌占絕大多數(shù)。

研究顯示細(xì)菌的主動(dòng)外排機(jī)制被認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的主要機(jī)制，染色體DNA 上的acrAB基因編碼的AcrAB-TolC 外排泵是大腸埃希菌最主要的主動(dòng)外排系統(tǒng)，可完成對(duì)抗生素、化學(xué)治療劑等多種藥物及膽鹽、染料、去污劑等的外排[6]，對(duì)細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境具有重要的意義。如果該系統(tǒng)失活，則菌株即從多重耐藥狀態(tài)變?yōu)槊舾袪顟B(tài)。該外排泵的構(gòu)成主要由膜融合蛋白（AcrA）、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）3 部分組成，以三聚體的形式穿越細(xì)菌內(nèi)膜和外膜，使之形成一個(gè)密封的通道，將物質(zhì)由胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨鈁7]。由于TolC 是多種外排泵外膜的共同通道，對(duì)于AcrAB-TolC 外排泵不具有特異性，因此本研究?jī)H檢測(cè)acra/acrb 基因在大腸埃希菌臨床株中的攜帶情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，acra/acrb 在多重耐藥組陽性率最高，分別為84.6%和80.8%，明顯高于其它3組，且多重耐藥組acra/acrb 基因陽性率與全敏感組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示acra/acrb 基因編碼的外排泵可能是大腸埃希菌多重耐藥重要的原因之一。值得注意的是，敏感組的大腸埃希菌也有攜帶acra/acrb 基因的菌株，考慮這些菌株中acra/acrb 基因沒有表達(dá)，或處于失活狀態(tài)。

AcrAB-TolC 外排泵屬RND 家族，以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能源。CCCP 是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解耦聯(lián)劑，通過抑制主動(dòng)外排能量來源的質(zhì)子濃度梯度，使主動(dòng)外排系統(tǒng)失去活性，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[8]。CCCP 抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用CCCP 后絕大多數(shù)多重耐藥大腸埃希菌對(duì)多種抗生素的MIC 比CCCP應(yīng)用前均有下降，最高下降倍數(shù)達(dá)128 倍，多數(shù)菌株對(duì)抗生素由耐藥變?yōu)槊舾小Ｓ纱丝梢?，在大部分大腸埃希菌臨床分離株中存在對(duì)抗菌藥物的主動(dòng)外排作用，CCCP 能有效抑制細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的主動(dòng)外排作用。MIC 下降倍數(shù)不等，說明外排泵主動(dòng)外排作用大小并不相同，或者其主動(dòng)外排機(jī)制可能與其它機(jī)制一同導(dǎo)致大腸桿菌抗菌藥物多重耐藥。

國內(nèi)外研究表明，外排泵抑制劑與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性，這為解決細(xì)菌的耐藥性問題提供了新思路。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有不同作用機(jī)制的外排泵抑制劑，但是許多在體外活性良好的外排泵抑制劑由于安全性、特異性、機(jī)制明確性等諸多問題未能用于臨床治療。因此,尋找有應(yīng)用前景的外排泵抑制劑對(duì)于細(xì)菌性感染的治療有著深遠(yuǎn)的意義。

［1］Higgins C F.Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters[J].Nature,2007,446（7137）:749

［2］Blair J M,Piddock L J.Stucture,function and inhibition of RND efflux pumps in Gram-negative bacteria:an update[J].Curr Opin Microbiol,2009,12（5）:512

［3］Schumacher A,Trittler R,Bohnert J A,et al.Intracellular accumulation of linezolid in Escherichia coli,Citrobacter freundii and Enterobacter aerogenes:role of enhanced efflex pump activity and inactivation[J].J Antimicrob Chemother,2007,59（6）:1261

［4］張海旺，鄧旭明，任曉慧.主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)的大腸桿菌多重耐藥性的確證[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005,25（2）:173

［5］卓超，蘇丹虹，倪語星,等.2009年中國CHINET 大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國感染與化療雜志，2010,10（5）:325

［6］Paixao L,Rodrigues L,Couto I,et al.Fluorometric determination of ethidium bromide efflux kinetics in Escherichia coli[J].J Biol Eng,2009,3:18

［7］Nagano K,Nikaido H.Kinetic behavior of the major multidurg efflux pump AcrB of Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106（14）:5854

［8］Zhang Z,Liu Z Q,Zheng P Y,et al.Influence of efflux pump inhibitors on the multidurg resistance of Helicobactor pylori [J].World J Gastroenterol,2010,16（10）:1279