TOX和SMAD3基因多態(tài)性與中國漢族人群2型糖尿病患者微血管病變的易感性相關(guān)

呂 佳，蔡春友，魏鳳江，張 紅，林靜娜，韓鴻玲，陳莉明，李衛(wèi)東

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，天津300384；3.天津市人民醫(yī)院，天津300121；4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；5.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津300070）

糖尿病微血管病變（microvascular complications of diabetes,MVCD）主要包括糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）和糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy,DR），是糖尿病最常見的并發(fā)癥，其致死率和致盲率呈逐年上升的趨勢。先前的研究證實，糖尿病病程的長短和血糖的控制情況是MVCD發(fā)病的危險因素[1-2]，然而，有些患者MVCD的發(fā)生與血糖控制的程度并不相關(guān)[3]。另外有大量的研究表明MVCD在不同種族中患病率具有明顯的差異，而且其家族聚集現(xiàn)象也很明顯，這些都提示遺傳因素在MVCD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。本研究以1 090名久居于天津地區(qū)的中國漢族2型糖尿病患者為研究對象，選取MVCD候選基因的SNP位點進行基因分型，旨在探討在中國漢族人群2型糖尿病患者中MVCD的遺傳背景和風(fēng)險基因。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究共收集了1 090名天津地區(qū)的2型糖尿病患者，均為漢族，相互之間沒有血緣關(guān)系，其中男性571人，女性519人，年齡在23～87歲之間，平均為（60.75±11.11）歲，患者均參照2010年美國糖尿病協(xié)會公布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[5]。其中DN患者共615人（DN診斷標(biāo)準(zhǔn)為:有糖尿病史且微白蛋白/肌酐>300mg/g，除外原發(fā)腎小球病和其他繼發(fā)腎小球疾病）。非DN糖尿病患者475人；非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者（DR）共290人，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）患者共87人，非DR糖尿病患者713人；同時罹患DN和DR的糖尿病患者共157人；糖尿病病程超過10年，非DN非DR患者共165人。糖尿病視網(wǎng)膜病變患者均經(jīng)眼底鏡或眼底照相檢查，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院兩名專家確診。調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用高鹽法（原平皓公司試劑盒）用來提取外周血白細胞基因組DNA，應(yīng)用Nanodrop 2000/2000c分光光度計測定樣品濃度及其在230 nm、260 nm及280 nm波長處的光密度（OD）值，記錄樣品濃度（μg/μL）和純度后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選基因及SNP的選擇 此次研究的候選基因一部分來自于2007年對2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study,GWAS）的結(jié)果[6-7]，以及先前本實驗室對糖尿病、肥胖候選基因SNP位點基因分型（genotyping）的結(jié)果（李衛(wèi)東等，待發(fā)表資料），另一部分來自于以往的相關(guān)報道和MVCD發(fā)生有關(guān)的生物學(xué)途徑。依據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫（The Single Nucleotide Polymorphism Database，db-SNP）中每個基因SNP位點的連鎖不平衡狀態(tài)和中國漢族人群的等位基因頻率，選擇了與糖尿病微血管病變有關(guān)的14個基因的23個SNP位點，并對這些SNP位點進行基因分型（表1）。

1.2.3 基因分型 1 090例2型糖尿病患者基因分型由IlluminaSNP芯片技術(shù)平臺進行。在進行基因分型時設(shè)重復(fù)對照，以便對基因分型結(jié)果進行監(jiān)測和質(zhì)量控制?；蚍中偷慕Y(jié)果錄入Filemaker Pro數(shù)據(jù)庫中。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用PLINK軟件對病例對照樣品進行二分變量的關(guān)聯(lián)分析，PLINK比較病例和對照組等位基因頻率，進行Chi方檢驗。在對照組的選擇上，我們采取兩種方案：（1）采用某種疾病(DN,DR,PDR和MVCD)的所有非患病個體作為對照；（2）以2型糖尿病病程超過10年，非DN非DR者作為對照 （n=165）。因為此次進行基因分型的SNP位點較少，并且相同基因SNP位點間存在連鎖不平衡，所以未對二分變量關(guān)聯(lián)分析進行多重檢驗的調(diào)整。

表1 糖尿病微血管病變候選基因SNP位點選擇Tab1 SNP selection ofMVCD candidategenes

2 結(jié)果

在1 090例糖尿病患者中，針對DN、DR、PDR和MVCD，對候選基因SNP位點進行了病例-對照的二分變量關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表2、表3。

以病程大于10年，無DN無DR糖尿病患者為對照，得到的關(guān)聯(lián)更加顯著：發(fā)現(xiàn)TOX基因的rs1526167位 點 與 DN（P=0.002，OR=0.60）、DR（P=0.011，OR=0.635）、PDR（P=0.044，OR=0.587）和MVCD（P=0.001，OR=0.596） 均存在顯著關(guān)聯(lián)，SMAD3基因的 rs12102171位點與 DN（P=0.042，OR=1.453）、DR（P=0.010，OR=1.656）、PDR（P=0.017，OR=1.947）和 MVCD（P=0.024，OR=1.507）均存在顯著關(guān)聯(lián)。而另一些基因（IGF2BP2、CDKAL1、ESR1）SNP位點則與DN或PDR有關(guān)聯(lián)（表2）。

表2 候選基因SNP位點與糖尿病微血管病變的關(guān)聯(lián)分析（P值）Tab2 Association analyses for candidategene SNPs and diabeticm icrovascular complications(P values)

表3 TOX和SMAD3基因SNP位點與糖尿病微血管病變的關(guān)聯(lián)分析Tab3 Associationsam ong TOX,SMAD3 gene SNPsand diabeticm icrovascu lar comp lications

3 討論

MVCD是糖尿病最常見的并發(fā)癥，是導(dǎo)致慢性腎功能不全和非外傷性致盲的主要原因，嚴(yán)重危害著糖尿病患者的健康。由于MVCD在不同人種中的患病率差異和明顯的家族聚集現(xiàn)象，人們對基因在MVCD發(fā)病中的作用日益重視。目前已有許多關(guān)于MVCD易感基因的研究報道，這些基因可以分為7類，分別是 VEGF[8]、EPO[9]、ACE[10]、IL1RN、PON1[11]、SOD2[12]和HFE，這些基因及其作用與糖尿病相關(guān)基因并不完全相同，表明MVCD遺傳性可能獨立于糖尿病自身的遺傳性。

此次研究采用大樣本、多基因的研究方法，探討MVCD在2型糖尿病患者中的易感基因，以揭示MVCD的遺傳背景。本實驗共收集了1 090名2型糖尿病患者，按照MVCD患病情況進行分組（DN、DR、PDR、MVCD），采用病例對照的方法進行二分變量的關(guān)聯(lián)分析。以往的MVCD遺傳學(xué)研究，均以健康人群為對照，忽略了血糖、病程等因素對實驗的影響。因此本次研究對照組選取165名病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者，盡量避免上述因素對實驗造成的影響。從結(jié)果可以看出，如果以病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者作為對照，盡管對照組人數(shù)較少(n=165)，但SMAD3、TOX基因SNP位點與DN、DR、PDR、MVCD的關(guān)聯(lián)更加顯著，提示SMAD3、TOX基因是MVCD的易感基因，且MVCD的遺傳背景與糖尿的遺傳背景不同。應(yīng)當(dāng)指出，有些2型糖尿病患者雖未發(fā)現(xiàn)微血管病變，但其已具備發(fā)生MVCD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，只是病程較短尚未發(fā)病，以這部分人作為對照來尋找MVCD的易感基因顯然值得商榷。我們采用病程>10年非DN非DR的T2D患者作為對照，可有效地檢出與MVCD相關(guān)(而不是與T2D有關(guān))的基因，誠然，本實驗這部分對照的人數(shù)尚少，在一定程度上影響了檢驗效能（power）。

目前對MVCD發(fā)病機制的研究已經(jīng)深入到了細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的層面，其中TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MVCD發(fā)生和發(fā)展中的作用（特別是與器官纖維化的關(guān)系）已經(jīng)得到了肯定[13]。SMAD3作為細胞膜受體和靶基因之間的關(guān)鍵橋梁，在TGF-β信號通路中發(fā)揮了核心作用，是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中不可或缺的重要介質(zhì)[14]。SMAD3基因具有多個SNP位點，這次我們選取rs1498506和rs12102171兩個位點。從本研究的PLINK結(jié)果中可以看出，SMAD3基因的 rs12102171與 DN、DR、PDR、MVCD均相關(guān)，與以往的研究結(jié)果相一致。

大量的研究表明，肥胖（尤其是內(nèi)臟型肥胖）是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素，而胰島素抵抗又是2型糖尿病發(fā)生的基礎(chǔ)。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)TOX基因與肥胖相關(guān)，這就提示我們TOX基因可能是MVCD的易感基因。TOX基因是位于人類第8號染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因。在此次研究中發(fā)現(xiàn)，該基因的 rs1526167位點與 DN、DR、PDR、MVCD均有相關(guān)性。本研究為進一步了解和探討MVCD的遺傳背景提供了有意義的線索，但由于MVCD的發(fā)生發(fā)展是多種遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用所決定的，所以還需進一步進行更大樣本量的、全基因組水平的研究。

[1]Freeman M S,Mansfield MW,Barrett JH,etal.Heritability of features of the insulin resistance syndrome in a community-based studyofhealthy families[J].DiabetMed,2002,19（12）:944

[2]KhazaiM H,Zargaran Z,Moosavi Z,etal.Diabetic complications and risk factors in recently diagnosed type 2 diabetes[J].ARYA,2010,2（2）:79

[3]Hietala K,Forsblom C,Summanen P,etal.Heritability ofproliferativediabetic retinopathy[J].Dlabetes,2008（8）:2176

[4]Wong TY,Klein R,Islam FM,etal.Diabetic retinopathy in amul ti-ethnic cohortin theUnited States[J].Am JOphthalmol,2006,141（3）:446

[5]American Diabetes Association.Standards ofmedical care in diabetes--2010[J].DiabetesCare,2010,33（Suppl1）:11

[6]Frayling TM.A new era in findings type 2 diabetesgenes：theunusualsuspects[J].DiabetMed,2007,24（7）:696

[7]Zeggini E.A new era for type 2 diabetes genetics[J].DiabetMed,2007,24（11）:1181

[8]Fouad H,Hamid A A,Azeem AAA,etal.Vascular endothelial growth factor（VEGF）gene insertion/deletion polymorphism and diabetic retinopathy in patientswith Type 2 Diabetes[J].Am Sci,2011,7（3）:199

[9]Tong Z,Aiello L P,Pollak M R,etal.Promoter polymorphism of the erythropoietin gene in severe diabetic eye and kidney complications[J].Proc NatlAcad SciUSA,2008,105（19）:6998

[10]Patel H V,Kalia K,Mannari J.Angiotensin converting enzyme（ACE）gene polymorphism increases the susceptibility of diabetic nephropathy in Western Indian Type 2 diabetic patients[J].Diabet Med,2011,31（4）:223

[11]Kao Y,Donaghue K C,Chan A,etal.Gene cluster is a genetic marker for earlymicrovascular complications in type 1 diabetes[J].DiabetMed,2002,19（3）:212

[12]Nomiyama T,Tanaka Y,Piao L.The polymorphism of manganese superoxide dismutase is associated with diabetic nephropathy in Japanese type2 diabetic patients[J].Hum Genet,2003,48（3）:138

[13]Nakamura S,IwasakiN,Funatsu H,etal.Impactof variants in the VEGF gene on progression of proliferative diabetic retinopathy[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009,247（1）:21

[14]Roberts A B,Russo A,FeliciA,etal.Smad 3 a key player in patho genesismechanisms dependent on TGF-beta[J].Ann N Y Acad Sci,2003,995:1