北豆腐中銅殘留量的評價

李佩然，阮長青，楊南

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

豆腐作為一種美食有著悠久的歷史，具有良好的保健功效，素有“植物肉”的美稱[1]。近年來，在食品生產(chǎn)過程中，違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑已成為影響我國食品安全的突出問題[2]。很多不法商家在利益的驅(qū)使下，使用工業(yè)氯化鎂代替食品氯化鎂作為豆腐的凝固劑，或者過量地使用食品級氯化鎂[3]。長期食用而造成重金屬中毒損害健康[4]。目前，北豆腐中氯化鎂引入重金屬的檢測方法至今未見報道。

銅作為典型的重金屬元素具有一定的毒性，長期食用銅含量超標的水及食品，銅就會積累在肝臟中，產(chǎn)生“肝痘”銅代謝及溶血和貧血等疾病[5]，因此，銅可作為部分食品重金屬污染的監(jiān)控指標。國家規(guī)定食品中銅含量的限量標準為10 mg·kg－1[6]。目前，食品中微量銅的測定方法有①原子吸收火焰光譜法[7-8]，其敏度高、選擇性好，但儀器昂貴、分析費用高；②分光光度法[9-10]，其操作簡便、精密度良好、儀器價格低，易于普及；③其他方法，如利用傳感器測定銅等[11-12]。

采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉法（分光光度法）和火焰原子吸收光譜法，通過檢測梯度添加食品級與工業(yè)級氯化鎂豆腐中的銅殘留量，確定其來源，為利用銅、鉛、砷等重金屬殘留量綜合評價過量使用食品級氯化鎂或違法使用工業(yè)級氯化鎂提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆（東北非轉(zhuǎn)基因大豆），食品級氯化鎂（MgCl2·6H2O含量46%；連云港益康佳化工有限公司），工業(yè)級氯化鎂（MgCl2·6H2O含量44.5%；天津長蘆漢沽鹽場有限責任公司），銅標準溶液（天津光復(fù)精細化工研究所），銅試劑（天津大茂試劑廠），硝酸，高氯酸，四氯化碳，檸檬酸銨，乙二胺四乙酸二鈉，硫酸，氨水，酚紅指示劑，所用試劑等級均為分析純及去離子水。

1.2 儀器設(shè)備

紫外可見光分光光度計（T6，北京普析通用有限公司），馬弗爐，電加熱板，原子吸收分光光度計（GC-112A，北京普析通用有限公司）。

1.3 標準溶液的配制

分光光度法：用0.5%硝酸溶液將1.0 mg·mL－1銅標準溶液逐級稀釋至濃度為 0、5.0、10.0、15.0、20.0和 25.0 μg·mL－1。銅標準溶液（1.0 mg·mL－1）用 0.5%的硝酸溶液多次稀釋，定容到10mL容量瓶，使銅標準使用液的終濃度分別為 0、5.0、10.0、15.0、20.0 和25.0 μg·mL－1，測定吸光度，并繪制標準曲線。

選擇最佳的儀器參數(shù)制作火焰原子吸收光譜法的標準曲線，銅標準使用液的終濃度分別為0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0 μg·mL－1，測定吸光度，并繪制標準曲線。

1.4 樣品溶液的制備

分別稱取10份150 g黃豆加入1000mL水浸泡12 h后制漿，濾除豆渣。凝固劑添加量分別為黃豆干物質(zhì)重量的2.4%、2.6%、2.8%、3.0%和3.2%，預(yù)先配制成濃度為8%工業(yè)級與食品級氯化鎂水溶液，在豆?jié){85℃時點漿，凝乳后將其破腦、壓榨，制成豆腐[13-14]。同時，收集壓榨的黃漿水待測定。

參照銅檢測標準GB/T 5009.13-2003制備樣品[15]，略作修改，方法如下。準確稱取2.0 g試樣，精確至0.0001 g，置于100mL瓷坩堝中，加入10mL濃硝酸，密封靜置24 h，小火蒸干，繼續(xù)加熱炭化至無煙后，移入馬弗爐中，500±25℃灰化4 h，取出放冷，再加5mL硝酸浸濕灰分，小火蒸干，再移入馬弗爐中2 h，冷卻后取出，如此反復(fù)灰化直至試樣無炭粒為止，以1mL硝酸（1+4）溶解4次，移入10.0mL容量瓶中，用水定容備用。

1.5 樣品的測定

分光光度法：采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉法檢測，于試樣消化液、試劑空白液和銅標準液中，各加入5mL檸檬酸銨，乙二胺四乙酸二鈉溶液和3滴酚紅指示劑，混勻，用氨水（1+1）調(diào)至紅色。各加2mL銅試劑溶液和10.0mL四氯化碳，劇烈振搖2min，靜置分層后，四氯化碳層經(jīng)脫脂棉濾入2 cm比色杯中，以四氯化碳調(diào)節(jié)零點，于波長440 nm處測吸光度值[15]。

試樣在紫外-可見分光光度計掃描到銅元素在440 nm處有最大吸收峰，在此波長下測定試樣的吸光度值，計算公式如下：

式中：X 為試樣中銅的含量，mg·kg－1；A1為試樣消化液中銅的吸光度值；A2為空白液中銅的吸光度值；m為試樣的質(zhì)量，g；V1為試樣消化液的總體積，mL；V2為測定所用試樣消化液體積，mL。

原子吸收光譜法：將處理后的樣液、試劑空白液和標準溶液分別導(dǎo)入調(diào)至最佳條件火焰原子化器進行測定。儀器選擇最佳工作條件：波長324 nm，燈電流 3.0 mA，狹縫寬度 0.4 nm，乙炔流量 12.0 L·min－1，空氣流量 15.0 L·min－1，燃燒頭高度 6.0 mm[15]。

試樣在原子吸收火焰光度計掃描銅元素在324 nm處有最大吸收峰，在此波長下測定試樣的吸光度值，計算公式如下：

式中：X 為試樣中銅的含量，mg·kg－1；A1為樣品中銅的吸光度值；A2為空白中銅的吸光度值；V為試樣處理后的總體積，mL；m為試樣的質(zhì)量。

1.6 方法的加標回收試驗與精密度試驗

回收率試驗：準確稱取3份一定量的豆?jié){樣品，分別加入 Cu2+濃度為 1.0 mg·kg－1的銅標準溶液1、5mL和10mL，按照上述試驗的方法分析測定Cu殘留量，進行加標回收實驗[16]。

精密度試驗：分別在7份樣品中添加1mL 1.0 mg·kg-1銅標準使用液[17]，按上述實驗方法進行分析測定，驗證該方法的精密度和準確性。

1.7 方法的最低檢出限

在最佳的實驗條件下，對試劑空白溶液進行11次測定，用3倍空白樣品吸光度值的標準偏差除以標準曲線斜率即為本方法的最低檢出限[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

分光光度法對應(yīng)的吸光度值分別為0.00、0.144、0.276、0.420、0.588 和 0.768，銅含量在 0.8～21.5 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.0304X-0.0137，R2=0.9965。

原子吸收光譜法對應(yīng)的吸光度值為0.000、0.018、0.038、0.078、0.117、0.153 和 0.208，銅含量在 0.01～0.155 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度和吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.0203X-0.0026，R2=0.9967。

2.2 樣品的測定

本實驗對樣品制作過程中的銅含量進行追蹤分析，點樣前豆?jié){銅含量為3.75 mg·kg-1，食品級氯化鎂中銅含量1.8 g·kg-1，工業(yè)級氯化鎂中銅含量4.0 g·kg-1，分別用分光光度法和原子吸收光譜法檢測豆腐以及黃漿水銅含量，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品中銅含量分析結(jié)果（mg·kg－1）Table 1 The copper content analysis results of the samples（mg·kg-1）

表1中凝固劑的添加量在2.4%～3.2%，由分光光度法的檢測結(jié)果可知，氯化鎂添加量在銅含量隨著豆腐及黃漿水中兩種氯化鎂添加量的增加而逐漸增大；梯度添加食品級、工業(yè)級氯化鎂的豆腐中銅含量范圍分別為 7.15～9.08 mg·kg-1和 10.79～12.87 mg·kg-1，黃漿水中分別為 2.69～2.72 mg·kg-1和 3.38～3.45 mg·kg-1，添加工業(yè)級氯化鎂的豆腐和黃漿水中銅含量偏高。通過單因素方差分析所得的P值可知，豆腐中隨著兩種凝固劑添加濃度的增加，導(dǎo)致銅含量明顯上升，P＜0.0001差異極顯著。而黃漿水中的銅含量并沒有因氯化鎂添加量而升高，P＞0.05差異不顯著。

測定結(jié)果表明，當食品級氯化鎂添加量大于3.2%時，豆腐中銅的殘留量才會超出國家限量；而工業(yè)級氯化鎂添加含量大于2.4%時，銅殘留量就超出了國家限量。為達到蛋白變性而使豆腐凝固的目的，工業(yè)氯化鎂的添加量應(yīng)該高于2.4%，即由雜質(zhì)引入的銅的含量必然超標。因此，根據(jù)豆腐中氯化鎂添加量的要求以及銅含量的測定結(jié)果，可以評價豆腐中是否存在過量使用食品級氯化鎂甚至使用工業(yè)氯化鎂作為凝固劑。

2.3 精密度實驗

驗證該方法的精密度和準確性，結(jié)果見表2。

表2 精密度實驗Table 2 The experiment of precision

由表2可知光光度法試驗銅含量結(jié)果相對標準偏差為9.43%，原子吸收光譜法試驗銅含量結(jié)果相對標準偏差為3.59%，兩種方法的精密度良好，均可滿足試驗要求。

2.4 加標回收試驗

加標回收實驗結(jié)果見表3。

表3 加標回收率Table 3 The recovery rate of copper

由表3可知，分光光度法測得銅的回收率在95.0%～103.4%之間，其平均回收率為98.5%；原子光譜法測得銅的回收率在99.0%～100.6%之間，其平均回收率為99.7%，兩種方法結(jié)果可靠，均可用于銅殘留量的分析。

2.5 最低檢出限的測定

本方法的最低檢出限結(jié)果見表4。

表4 最低檢出限Table 4 Theminimum detection limit of method

計算出分光光度法銅的檢出限為0.106 mg·kg-1，以1.00 g樣品消化后定容至10mL，樣品最低檢出限為 1.06 mg·kg-1；原子吸收光譜法的檢出限為0.00504 mg·kg-1，以 1.00 g樣品消化后定容 10mL，樣品最低檢出限為0.0504 mg·kg-1。

3 討論

3.1 北豆腐制作工藝過程中，凝固劑氯化鎂的添加量直接影響豆腐成型及其品質(zhì)，凝固劑添加量占黃豆干物質(zhì)重的2.4%～3.2%之間，豆腐凝固成型具有良好的口感；超出此梯度區(qū)間范圍直接影響豆腐品質(zhì)，凝固劑添加量小于2.4%，豆腐水嫩不成易型；凝固劑添加量大于3.2%，豆腐過老無口感，試驗失去意義。因此試驗選取2.4%、2.6%、2.8%、3.0%和3.2%凝固劑添加量為測定指標，檢測豆腐中工業(yè)氯化鎂與食品氯化鎂之間的差異，探索檢測違法添加物工業(yè)氯化鎂的分析方法，同時對黃漿水中銅殘留量進行對比分析。

3.2 試驗以分光光度法和原子吸收光譜法進行檢測分析，并通過回收率、精密度和最低檢出限等試驗進行驗證。試驗結(jié)果表明，兩種方法均滿足試驗的分析要求并取得良好的結(jié)果。由于原子吸收光譜法所用儀器昂貴，分析費用較高，一般的檢測機構(gòu)及食品生產(chǎn)廠家尚不具備此條件；而分光光度法操作簡便，儀器檢測費用較低，適用于大多數(shù)檢測機構(gòu)，食品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用分光光度法進行檢測更具有現(xiàn)實可行性。

3.3 試驗分別檢測梯度添加工業(yè)氯化鎂與食品氯化鎂制成豆腐中銅的殘留量，通過對比分析發(fā)現(xiàn)：添加食品氯化鎂和工業(yè)氯化鎂的豆腐，檢測值差異顯著；黃漿水中銅殘留量的檢測結(jié)果差異較小，二者基本上呈現(xiàn)持平的趨勢，因此試驗選擇檢測豆腐中銅殘留量區(qū)別添加工業(yè)氯化鎂與食品氯化鎂。試驗結(jié)果分析表明，由于豆腐中蛋白質(zhì)的凝結(jié)作用，導(dǎo)致黃漿水中重金屬銅殘留量相對較低，大部分銅離子都被阻隔在豆腐當中，不能隨著壓力的作用隨黃漿水流出，因此黃漿水中銅含量差異微小，豆腐中銅含量差異顯著。

3.4 研究結(jié)果表明，添加食品級氯化鎂的豆腐中，銅殘留量已接近國家規(guī)定的限量標準10 mg·kg－1，出于對食品安全的考慮，建議生產(chǎn)廠家在添加氯化鎂的過程中降低添加量或選取其他凝固劑復(fù)合添加[19]；添加工業(yè)氯化鎂的豆腐中，銅殘留量超出國家規(guī)定的限量標準，因此，檢測豆腐中銅殘留量可作為區(qū)分豆腐中是否添加工業(yè)氯化鎂的一種方法。添加食品氯化鎂與工業(yè)氯化鎂豆腐中銅殘留量差異顯著，證明通過檢測重金屬的方法鑒定違法添加凝固劑的試驗具有可行性，今后將繼續(xù)綜合分析豆腐中As、Pb、Hg等重金屬元素的含量，為評價豆腐中違法添加物提供方法指導(dǎo)。

4 結(jié)論

利用分光光度法與原子吸收光譜法檢測了梯度添加工業(yè)氯化鎂與食品氯化鎂豆腐中銅的殘留量，獲得了方法的精密度、回收率和最低檢出限。研究結(jié)果證實了豆腐中銅殘留量超過食品中銅限量標準源于過量使用食品級氯化鎂或違法使用工業(yè)級氯化鎂，該方法對于利用銅與氯化鎂中的其他重金屬的殘留量評價氯化鎂的使用情況具有指導(dǎo)意義。

［1］徐渡新，鄭文年，徐洪，等.實驗探究豆腐的主要成分與性質(zhì)［J］.阜陽師范學(xué)院學(xué)報，2010，27（3）：88-90.

［2］徐立青，孟非.中國食品安全研究報告［M］.北京：科學(xué)出版社，2012.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單：第四批［EB/OL］.［2012-03-22］.http：//www.moh.gov.cn/mohwsjdj/s9164/201004/46534.shtml.

［4］Islam EU，Yang X E ，He Z L ，et al.Assessing potential dietary toxicity of heavy metals in selected vegetables and food crops ［J］.Journal of Zhejiang University Science B（Life Science），2007，8（1）：1-13.

［5］劉柯，何君，張瑞斌，等.德州市郊蔬菜中重金屬的含量檢測及對策研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：346-348.

［6］GB15199-94.食品中銅限量衛(wèi)生標準［S］.

［7］萬正楊，閆江虹.微波消解-原子吸收分光光度法測定茶葉中的微量元素［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（12）：1459-1460.

［8］董丙坤，徐慧琴.原子吸收分光光度法測定蔬菜水果中的微量元素銅［J］.河南農(nóng)業(yè)，2008，22：51-52.

［9］Moyaa H D，Dantonib P，Rocha F R P，et al.A multicommuted flow-system forspectr-ophotometric determination of tannin exploiting the Cu（Ⅰ）/BCA complex formation［J］.Microchemical Journal，2008，88（1）：21-25.

［10］Liang P，Yang J.Cloud point extraction preconcentration and spectrophotometric determination of copper in food and water samples using amino acid as the complexing agent［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（1）：95-99.

［11］Yuce M，Nazir H，Ddnmez G.A voltammetric rhodotorula mucilaginosa modified microbial biosensor for Cu（II）determination［J］.Bioelectrochemistry，2010，79（1）：66-70.

［12］Narayana L S ，Reddy J K ，Reddy A S ，et al.Extractive spectrophotometric reagent for the determination of Cu（II） in food and water samples ［J］.Food Analytical Methods，2008（4）：293-299.

［13］曾潔，趙秀紅.豆類食品加工［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［14］范志軍，江連洲.豆?jié){生產(chǎn)中提高大豆蛋白質(zhì)抽出率的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2011，23（6）：64-68.

［15］GB/T 5009.13-2003.食品中銅的測定方法［S］.

［16］李志熙，王瑞斌.蔬菜中微量銅的測定方法［J］.食品科學(xué)，2009，30（18）：258-260.

［17］周志，唐巧玉，汪興平，等.微波消解—原子吸收法快速測定莼菜中銅、鋅的含量［J］.食品科學(xué)，2007，28（6）：285-287.

［18］傅書林，藍潔娜.焙烤咖啡豆中銅的測定［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（7）：84-85.

［19］謝微，車康，汪春，等.低嘌呤脫脂豆腐粉凝固劑凝固效果研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2012，24（2）：71.