野生黃花苜蓿胚性愈傷誘導(dǎo)研究

摘要：為優(yōu)化黃花苜蓿胚性愈傷培養(yǎng)條件，本研究以黃花苜蓿（Medicago falcata L.）為試驗(yàn)材料，探討培養(yǎng)基、外植體、激素濃度以及凝固劑對(duì)黃花苜蓿胚性愈傷形成的影響。結(jié)果表明，以成熟胚為外植體接種至MS培養(yǎng)基的愈傷塊呈淡黃色，質(zhì)地為粘性且體積較大，該處理下添加1 mg·L-12，4-D和0.05 mg·L-1KT愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)95.24%。利用該培養(yǎng)條件進(jìn)一步探究了凝固劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加6 g·L-1瓊脂和7 g·L-1植物凝膠可以有效降低愈傷組織褐化率。因此，誘導(dǎo)黃花苜蓿最適培養(yǎng)基為：以成熟胚為外植體，其成分包括MS培養(yǎng)基，添加1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1瓊脂/7 g·L-1植物凝膠。

關(guān)鍵詞：黃花苜蓿；愈傷組織；成熟胚；凝固劑

中圖分類號(hào)：S541.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" """"文章編號(hào)：1007-0435（2024）07-2143-08

Study on Embryogenic Callus Induction of Wild Medicago falcata L.

WANG Shu-shuan1， ZHANG Yu-tong1， SHI Ru-ru1， GAO Cui-ping1， GAO Xia1，

NIE Yu-dong2， SHI Feng-ling1*

（1.Key Laboratory of Grassland Resources Education， College of Grassland and Resources and Environment， Inner Mongolia

Agricultural University， Hohhot Inner Mongolia 010019， China; 2.Inner Mongolia Autonomous Region Forestry and

Grassland Seedling Station， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China）

Abstract：In order to optimize the induction of embryonic callus in alfalfa （Medicago falcata L.） from Xinjiang，the effects of culture medium，explants，hormone concentration and gelling agents on the formation of alfalfa callus tissue were investigated. The results showed that the callus inoculated into MS medium with mature embryo as explants were light yellow，viscous in texture and large in volume，the callus induction rate reached 95.24 % when 1 mg·L-12，4-D and 0.05 mg·L-1KT were added. The effect of coagulant on callus induction was further explored by using this culture condition，it found that the addition of 6 g·L-1 agar and 7 g·L-1 phytagel to the medium effectively reduced the browning rate of callus. Therefore，the optimal medium for inducing alfalfa was mature embryos as explants，and the medium composition was MS+1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1 agar or 7 g·L-1 phytagel.

Key words：Medicago falcata L.;Callus tissue;Mature embryo;Gelling agents

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.015

引用格式：

王樹栓，張雨桐，石如如，等.野生黃花苜蓿胚性愈傷誘導(dǎo)研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（7）：2143-2150

WANG Shu-shuan， ZHANG Yu-tong， SHI Ru-ru，et al.Study on Embryogenic Callus Induction of Wild Medicago falcata L.［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2143-2150

收稿日期：2023-12-25；修回日期：2024-03-02

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（2021ZD0031）；內(nèi)蒙古自治區(qū)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2022JBGS0016）資助

作者簡(jiǎn)介：

王樹栓（1998-），女，漢族，內(nèi)蒙古錫林郭勒盟人，碩士研究生，主要從事牧草遺傳育種研究，E-mail：wss980205@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：shifengling@imau.edu.cn

植物基因工程對(duì)于牧草品質(zhì)的改良和新品種的選育具有十分重要的意義［1］，其中，組織培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于苜?？剐杂N等方面的研究。苜蓿組織培養(yǎng)研究開展40多年來，我國學(xué)者對(duì)苜蓿的離體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞雜交以及抗性材料篩選都進(jìn)行了研究［2-4］，其中以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）報(bào)道居多。Walker等［5］報(bào)道了激素和培養(yǎng)基配方對(duì)不同基因型紫花苜蓿體外誘導(dǎo)的影響。Amini等［6］通過向體細(xì)胞胚培養(yǎng)基中添加菟絲子提取物來提高紫花苜蓿體細(xì)胞胚離體成熟、植株再生和轉(zhuǎn)化效率。黃花苜蓿（Medicago falcata L.）的生態(tài)適應(yīng)性和抗逆能力高于紫花苜蓿，同時(shí)具有豐富的遺傳背景，是我國北方高寒地區(qū)改良苜蓿育成新品種重要的基因源［7］。此外，黃花苜蓿根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的固氮能力，在生態(tài)修復(fù)以及防風(fēng)固沙等方面也有重要的利用價(jià)值，是國內(nèi)北方建設(shè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)人工草地的首選［8］。苜蓿組織培養(yǎng)的外植體多為無菌苗的子葉和下胚軸，易出現(xiàn)培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)條件相差較大和誘導(dǎo)率不一致等問題。劉芳等［8］從外植體和激素等方面探討影響新疆野生黃花苜蓿愈傷誘導(dǎo)的因素，并利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將含硫氨基酸AK-APR基因整合到黃花苜?；蚪M，成功得到轉(zhuǎn)基因苗；李娟等［9］以下胚軸和子葉為外植體，優(yōu)化培養(yǎng)流程后，新疆野生黃花苜蓿愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)92%～95%，體胚發(fā)生率和體胚萌發(fā)成苗率也較高，再生周期約為70～80 d。成熟胚取材不限季節(jié)限制，誘導(dǎo)效率較高，且可以直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，是苜蓿實(shí)現(xiàn)高效率遺傳轉(zhuǎn)化的可靠材料。黃花苜蓿遺傳多樣性豐富，不同品種間遺傳差異較大［7］，因此不同品種或不同基因型間培養(yǎng)條件差異較大。本試驗(yàn)探討了外植體、培養(yǎng)基、激素以及凝固劑對(duì)黃花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以得到黃花苜蓿良好的胚性愈傷為目標(biāo)，為黃花苜蓿誘變育種和基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供一定的參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為二倍體黃花苜蓿（Medicago falcata L.）種子，2019年采集于新疆地區(qū)，保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子實(shí)驗(yàn)室。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1" 種子預(yù)處理" 挑選成熟飽滿的黃花苜蓿種子，用98%濃硫酸浸泡種子40 min，處理完畢后在流水下沖洗30～40 min，移入超凈工作臺(tái)用75%酒精震蕩漂洗30 s，無菌水沖洗3～5次，然后用10%次氯酸鈉（NaClO，有效氯濃度≥10%）浸泡30 min，再用無菌水沖洗6～7次。

1.2.2" 愈傷組織誘導(dǎo)" 將消毒種子分為兩部分，一部分接種于1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)，7 d后取無菌苗切取2 mm子葉和2～4 mm下胚軸為外植體接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；另一部分消毒種子用解剖針和鑷子剝?nèi)シN皮，將成熟胚接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為25℃，20 d暗培養(yǎng)10 d光照培養(yǎng)（光周期16 h·d-1，光照強(qiáng)度1 800～2 000 lx）。

1.2.3" 愈傷誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基配置" 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），設(shè)四因素三水平。以黃花苜蓿下胚軸、子葉和成熟胚為外植體，在 MS和N6培養(yǎng)基中分別添加不同濃度配比的2，4-D（1，2，3 mg·L-1）、KT（0.05，0.1，0.15 mg·L-1），以及水解酪蛋白（CH，0，1，2 g·L-1），每個(gè)培養(yǎng)基添加30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，pH值5.8。

由上述試驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)愈傷最佳的處理組合為培養(yǎng)基基本成分，進(jìn)一步篩選不同凝固劑種類及濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。以成熟胚為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分為MS+2，4-D 1 mg·L-1+ KT 0.05 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖，再分別添加瓊脂（5，6，7，8 g·L-1）和植物凝膠（5，6，7，8 g·L-1）作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的凝固劑，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為25℃暗培養(yǎng)。第21天統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化程度，并將愈傷情況較好的胚性愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH值為5.8。上述MS和N6培養(yǎng)基均來自北京索萊寶科技有限公司，植物凝膠來自上海源葉生物科技有限公司，2，4-D和KT來自合肥博美生物科技有限公司，瓊脂和蔗糖來自天津市大茂化學(xué)試劑廠，CH來自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2.4" 統(tǒng)計(jì)方法" 愈傷誘導(dǎo)率=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

褐化率=褐化面積gt;50%的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.5" 數(shù)據(jù)分析" 利用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism 9進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理和圖形繪制，采用 SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果分析

如表1所示，各處理愈傷誘導(dǎo)情況差異較大，誘導(dǎo)率為15%～100%，褐化率最高達(dá)到95%，最低為11.9%。愈傷組織生長狀態(tài)見圖1：（Ⅰ）愈傷塊表面濕潤且結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)地為粘性，顏色為淡黃色或黃綠色，體積較大；（Ⅱ）愈傷塊體積較小，表面干燥，白霜較多；（Ⅲ）多數(shù)外植體并未膨大，組織為干塊狀，生長緩慢；（Ⅳ）愈傷塊較小，褐化較為嚴(yán)重。

第20 d觀察各培養(yǎng)基愈傷塊情況，發(fā)現(xiàn)以成熟胚為外植體的處理下褐化程度較低，基本不存在褐化，但以下胚軸和子葉為外植體的培養(yǎng)基中愈傷塊體積較小，褐化數(shù)較多；培養(yǎng)至30 d，各培養(yǎng)基中褐化數(shù)增多，M1，M2和M3培養(yǎng)基中有部分胚狀體出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。第30 d統(tǒng)計(jì)各處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率，發(fā)現(xiàn)M4～M6和N4～N6誘導(dǎo)率均為100%，但褐化率達(dá)62.5%～95.83%，大部分愈傷塊呈黃褐色，其中以M4褐化率最高。綜合來看，以成熟胚為外植體的培養(yǎng)基愈傷情況較好，誘導(dǎo)率較高且褐化率較低，愈傷塊顏色呈淺黃色或黃綠色，生長量較大，培養(yǎng)20 d便可移入增殖培養(yǎng)基。圖2為增殖培養(yǎng)兩周后愈傷組織的生長狀態(tài)，部分愈傷塊可以直接分化出體細(xì)胞胚，出現(xiàn)類似球形或子葉型的胚狀結(jié)構(gòu)。

2.2" 不同培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

暗培養(yǎng)30 d后，從整體來看三種外植體在MS培養(yǎng)基上的愈傷誘導(dǎo)率較高，兩者相差6.48%，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的褐化率總體為51.92%，低于N6培養(yǎng)基（圖3）。兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)不同外植體的愈傷結(jié)果如圖4所示，以下胚軸為外植體時(shí)，兩種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和褐化率差異不大，誘導(dǎo)率均為100%，但褐化情況較為嚴(yán)重；以成熟胚為外植體時(shí)，MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為91.47%，N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為93.69%，N6培養(yǎng)下褐化率較高，為36.37%；子葉為外植體時(shí)，兩種培養(yǎng)基愈傷情況差異較大，MS培養(yǎng)下的誘導(dǎo)率高于N6，兩者相差21.67%，MS培養(yǎng)基中愈傷組織的褐化率為56.7%，N6培養(yǎng)基中為74.2%。

2.3" 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

三種外植體誘導(dǎo)愈傷組織的結(jié)果如圖5所示，下胚軸為外植體的愈傷誘導(dǎo)率最高，為100%，顯著高于子葉的愈傷誘導(dǎo)率（Plt;0.05），其次為成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，出愈率為92.58%，顯著高于子葉的愈傷誘導(dǎo)率（Plt;0.05）。三種外植體均存在褐化現(xiàn)象，以下胚軸誘導(dǎo)的愈傷塊褐化現(xiàn)象最為嚴(yán)重，褐化率達(dá)到75.69%，大部分愈傷組織無法繼續(xù)正常生長培養(yǎng)。子葉誘導(dǎo)的愈傷組織褐化率為65.42%，與下胚軸沒有顯著差異，愈傷組織多數(shù)為干塊狀，愈傷情況同樣較差（表1）。成熟胚誘導(dǎo)的愈傷塊褐化程度較輕，褐化率為28.85%，愈傷組織多數(shù)呈淡黃色，質(zhì)地較粘，出現(xiàn)芽點(diǎn)較早。

2.4" 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以成熟胚、下胚軸和子葉為外植體，接種至不同激素濃度的培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率和褐化率見表2。以成熟胚為外植體，2，4-D和KT濃度分別為1 mg·L-1和0.05 mg·L-1時(shí)，胚性愈傷誘導(dǎo)率為95.24%，褐化率為19.05%，該處理下的胚性愈傷塊誘導(dǎo)率較高且褐化率最低。在兩種激素比值相同的情況下，愈傷組織褐化率隨著激素濃度和CH含量的增高而增加；將下胚軸接種至含有不同濃度激素的培養(yǎng)基中，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)100%，但愈傷塊的褐化程度顯著高于以成熟胚為外植體時(shí)的處理（Plt;0.05），褐化率最高可達(dá)89.58%；以子葉為外植體時(shí)，誘導(dǎo)率顯著低于其他處理（Plt;0.05），其中以添加1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1KT+2 g·L-1 CH時(shí)誘導(dǎo)率最低，愈傷誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度的增加而增大，不添加CH時(shí)愈傷組織的褐化率最低。

2.5" 不同凝固劑對(duì)成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果

以成熟胚為外植體，接種至含有不同凝固劑的培養(yǎng)基中，各處理間的愈傷誘導(dǎo)率差異較?。ū?）。凝固劑為瓊脂時(shí)，Q7的誘導(dǎo)率顯著低于其他處理（Plt;0.05），Q5和Q8處理的誘導(dǎo)率均為100%，其中Q6和Q8處理的褐化率較低（Plt;0.05）。此外，愈傷塊均出現(xiàn)白霜現(xiàn)象，Q6和Q7培養(yǎng)基中的愈傷塊白霜數(shù)較少；凝固劑為植物凝膠時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率均為100%，但褐化率普遍較高，最高可達(dá)37.5%，顯著高于以瓊脂為凝固劑的各處理（Plt;0.05），Z7的褐化率和白霜數(shù)與其他處理相比較低；總體來看，Q6和Z7培養(yǎng)基中愈傷塊生長情況較好，愈傷率高的同時(shí)，褐化率和白霜數(shù)較低。將生長情況較好的愈傷塊移入增殖培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)個(gè)別胚性愈傷組織出現(xiàn)直接分化體細(xì)胞胚的現(xiàn)象，并且在長時(shí)間內(nèi)保持分化能力不發(fā)生褐化。

3" 討論

3.1" 培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷組織的影響

MS是組織培養(yǎng)中常見的培養(yǎng)基，適用于大多數(shù)雙子葉植物，其特點(diǎn)是銨鹽和硝酸鹽的含量較高，能滿足植物組織對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)的要求。在黃花苜蓿的組織培養(yǎng)中，應(yīng)用最廣泛的也是MS培養(yǎng)基［10］。白靜仁等［11］采用改良的MS培養(yǎng)基通過培養(yǎng)分化黃花苜蓿原生質(zhì)體得到完整的再生植株，伊鳳艷等［12］同樣采用MS培養(yǎng)基，以下胚軸和子葉為外植體，探究不同激素配比對(duì)黃花苜蓿愈傷誘導(dǎo)及分化的影響，結(jié)果表明下胚軸誘導(dǎo)率可達(dá)100%，分化率達(dá)80%。B5培養(yǎng)基通常適用于單子葉植物，銨鹽含量較低。Shao等［13］比較了MSH和B5兩種轉(zhuǎn)化再生體系，其中MSH通過直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生來完成植株再生，使培養(yǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短為10～14周。

N6培養(yǎng)基最初主要應(yīng)用于水稻等禾谷類作物的花藥培養(yǎng)，目前在苜蓿組織培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)中也被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)對(duì)比了MS和N6兩種培養(yǎng)基對(duì)黃花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基中愈傷組織的褐化率較低，以成熟胚和下胚軸為外植體時(shí)，兩種培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較小，誘導(dǎo)率可達(dá)91%～100%。N6培養(yǎng)基中含有豐富的N和K但不含鉬，而MS培養(yǎng)基中的微量元素可為苜蓿提供生長發(fā)育所需的鉬，為愈傷組織的生長提供更為全面的營養(yǎng)物質(zhì)［9］，因此MS培養(yǎng)基更有利于苜蓿誘導(dǎo)胚性愈傷及愈傷組織分化成苗［14］。王紅梅［15］以無菌苗子葉和下胚軸為外植體，采用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，苜蓿愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)100%，且愈傷組織生長情況良好。馬海燕等［16］以三種苜蓿無菌苗的下胚軸為外植體，探究?jī)煞N誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS為誘導(dǎo)苜蓿愈傷有效的培養(yǎng)基。

3.2" 外植體種類對(duì)愈傷組織的影響

外植體的選擇也是影響愈傷形成的重要因素，任何植物器官都具備發(fā)育成完整植株的能力，但再生能力存在差異。李波等［17］采用不同苜蓿的下胚軸、葉片、子葉和莖來探究不同品種間不同外植體愈傷誘導(dǎo)的結(jié)果，結(jié)果表明同一品種不同外植體的出愈率有明顯差異，其中下胚軸誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率為99.4%，褐化率最低。溫之雨等［18］利用紫花苜蓿的子葉為外植體建立了高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生及成苗體系，利用該體系成功獲得抗蚜轉(zhuǎn)基因苜蓿。在苜蓿培養(yǎng)中，通常認(rèn)為下胚軸是誘導(dǎo)胚性愈傷最佳的外植體，誘導(dǎo)率高并且出愈快，其次為子葉，是目前豆科牧草尤其是苜蓿愈傷誘導(dǎo)及再生體系建立中常用的外植體［19-20］。而國內(nèi)關(guān)于苜蓿成熟胚誘導(dǎo)胚性愈傷的研究未見報(bào)道，成熟胚與其他外植體材料相比取材更容易，能夠長期保存，并且不受季節(jié)和植株發(fā)育時(shí)期的限制，能夠滿足遺傳轉(zhuǎn)化研究工作中的大量重復(fù)性工作［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，以成熟胚為外植體，黃花苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯高于下胚軸和子葉，褐化程度較輕，且胚性持續(xù)時(shí)間長，可為黃花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化工作提供新的思路。田娟等［22］探究了基因型、消毒方法以及培養(yǎng)基等條件對(duì)燕麥成熟胚胚性愈傷誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明添加低濃度的CH以及6 g·L-1的植物凝膠更有利于愈傷誘導(dǎo)；肖燕等［23］通過優(yōu)化成熟胚誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)配方，愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)74%。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同外植體下黃花苜蓿愈傷組織的出愈率和褐化率差異極大，以成熟胚為外植體的愈傷塊不僅出愈快，而且愈傷組織生長發(fā)育情況較好，與下胚軸和子葉相比成熟胚誘導(dǎo)的愈傷塊體積更大，褐化程度較輕，更適用于黃花苜蓿胚性愈傷的誘導(dǎo)和后續(xù)體細(xì)胞胚的發(fā)生，成熟胚培養(yǎng)技術(shù)也被應(yīng)用于植物合成同源多倍體的研究，并且可能會(huì)擴(kuò)大相同重復(fù)基因組的表型變異，為新品種的選育創(chuàng)造機(jī)會(huì)［24］。

3.3" 激素濃度對(duì)愈傷組織的影響

生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度也是影響愈傷形成的重要因素，激素配比以及濃度的變化會(huì)引起植物愈傷組織誘導(dǎo)效率的差異［25］。李望豐等［26］篩選了對(duì)2，4-D敏感，并且體胚發(fā)生效率高和分化高的苜蓿品種，進(jìn)一步完善了苜蓿再生體系，對(duì)于苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重大意義。趙曉倩［27］利用甘農(nóng)四號(hào)紫花苜蓿的不同外植體，探究不同濃度2，4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明添加不同質(zhì)量2，4-D的培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著，誘導(dǎo)率均達(dá)到90%以上。徐舶等［28］研究表明誘導(dǎo)呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幱鷤纬傻淖罴雅囵B(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+0.5 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1KT。有報(bào)道稱，適量濃度的2，4-D才會(huì)增加植物的愈傷誘導(dǎo)率，而過低或過高的劑量對(duì)愈傷形成是不利的［29］。在豆科牧草組織培養(yǎng)的研究中，同樣認(rèn)為2，4-D在誘導(dǎo)胚性愈傷過程中是不可缺少的，其與KT的配合使用更有利于胚性愈傷的生長和體細(xì)胞胚的形成［30］?？导t霞等［31］研究表明，NAA（萘乙酸）對(duì)紅豆草愈傷誘導(dǎo)的影響程度大于ZT（玉米素）和6-BA。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加了不同濃度和配比的2，4-D和KT，觀察到添加適量的2，4-D對(duì)于黃花苜蓿胚性愈傷的誘導(dǎo)是十分有利的，以成熟胚為外植體時(shí)低劑量的2，4-D與低劑量的KT搭配使用愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)95.24%，隨著激素濃度的升高，但比值不變的情況下，誘導(dǎo)率在逐漸下降，而褐化率隨著升高。而以下胚軸和子葉為外植體時(shí)，隨著2，4-D濃度的增高，褐化率在逐漸減小。侯永霞等［31］研究表明，MS培養(yǎng)基中添加1 mg·L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 6-BA，黃花苜蓿子葉和下胚軸的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，愈傷狀態(tài)也較好，而隨著2，4-D濃度的增大，愈傷組織褐化程度加重。因此，激素種類以及外植體類型是影響愈傷誘導(dǎo)率和褐化率的重要原因。

CH廣泛應(yīng)用于苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)的研究中，對(duì)于花藥愈傷的質(zhì)量和愈傷分化具有良好的促進(jìn)作用［32，33］。靳慧卿等［4］研究表明添加1 g·L-1CH有利于提高‘中苜2號(hào)’和‘草原3號(hào)’的體胚發(fā)生率。不添加CH的培養(yǎng)基中愈傷組織生長狀況較好，而高劑量的愈傷誘導(dǎo)率有降低趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镃H對(duì)黃花苜蓿愈傷誘導(dǎo)的影響較小，使用濃度過高反而存在抑制作用。

3.4" 凝固劑對(duì)成熟胚愈傷組織的影響

固體培養(yǎng)基通常使用凝固劑使培養(yǎng)基在常溫下凝固，也可以吸附某些代謝有害物質(zhì)，凝固劑能夠直接影響培養(yǎng)基的通透性。在苜蓿組織培養(yǎng)中最常用的凝固劑為瓊脂，通常用量在0.6%～0.8%。此外，植物凝膠Phytagel和Gelrite也被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)，并有研究表明Phytagel和Gelrite在愈傷組織誘導(dǎo)方面優(yōu)于瓊脂［34-35］。黃花苜蓿愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.6%瓊脂和0.7%植物凝膠均有利于成熟胚的愈傷誘導(dǎo)，愈傷塊的生長狀況優(yōu)于其他處理。

4" 結(jié)論

本試驗(yàn)成功篩選得到適用黃花苜蓿胚性愈傷誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即以成熟胚為外植體，培養(yǎng)基成分為MS+1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1瓊脂或7 g·L-1植物凝膠，該處理下愈傷塊表現(xiàn)最佳，表面濕潤，質(zhì)地為粘性且愈傷組織體積較大。

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