自然發(fā)酵東北酸菜中植物乳桿菌的分離與鑒定

王欣，李卯生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

酸菜在我國歷史悠久，早在1400 多年前《齊民要術(shù)》一書中就有記載酸菜的加工方法。我國東北和華北各地，由于冬季時(shí)間長，鮮菜不宜貯藏，廣泛采用這種方法制作酸菜，可貯藏半年左右[1]。酸菜是經(jīng)過乳酸發(fā)酵而制成的一種鹽漬菜，最初是以保藏大白菜為目的，其腌漬液含鹽量較低，在腌漬過程中借助于天然附著在蔬菜表面的微生物進(jìn)行乳酸發(fā)酵，使成品具有酸、甜、香等獨(dú)特風(fēng)味而深受人們喜愛，得以在中國尤其在北方民間廣泛發(fā)展，成為冬季主要蔬菜來源之一。

我國傳統(tǒng)的腌漬酸菜大多數(shù)采用自然接種發(fā)酵工藝，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，風(fēng)味各異。它是利用蔬菜表面的附著微生物自然發(fā)酵，由于蔬菜表面微生物十分復(fù)雜，它們對發(fā)酵過程中以及酸菜制品的風(fēng)味、品質(zhì)都具有影響[2-3]。在發(fā)酵初期，好氧菌和酵母是占優(yōu)勢的微生物，乳酸菌的數(shù)量較少[4]。如果腌制過程未能做到嚴(yán)格的厭氧，則假絲酵母、紅色圓球酵母就會大量繁殖，消耗乳酸而降低酸菜中乳酸含量，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量[5]。試驗(yàn)從酸菜發(fā)酵液中分離到一個(gè)菌株，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料

1.1 酸菜

黑龍江省北安市某酸菜生產(chǎn)廠，生產(chǎn)批號20121025。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

乳酸菌分離固體培養(yǎng)基，MRS 培養(yǎng)基，SL 培養(yǎng)基，PY 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，HP 培養(yǎng)基，YG 瓊脂培養(yǎng)基等購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、乳酸石碳酸棉蘭染液、DNA 提取緩沖液、溶菌酶、T 載體、SDS、氯仿、異戊醇、異丙醇、去離子水、纖維素酶、70%冰乙醇、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒、Taq DNA Polymerase、dNTP EDTA、BufferW1、BufferW2 Eluent、Buffer DE-A、Buffer DE-B 購于大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物

乳酸菌16SrRNA 基因擴(kuò)增引物上游引物序列為5′-ACAGCTGCTGGTGCTGGC AATG-3′，下游引物序列為5′-TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 方法

2.1 乳酸菌菌落的分離純化

取味道純正的自然發(fā)酵酸菜汁為分離樣，10 倍倍比稀釋后涂布在平板上，并在27～28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取周圍有透明圈的單個(gè)菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下鏡檢。

2.2 乳酸菌個(gè)體的生理生化鑒定

對分離株分別進(jìn)行H2O2酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、精氨酸試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、木糖試驗(yàn)、鼠李糖麥芽糖試驗(yàn)、蔗糖試驗(yàn)、乳糖試驗(yàn)、山梨糖試驗(yàn)、菊糖試驗(yàn)、纖維二糖試驗(yàn)和甘露糖試驗(yàn)等。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 DNA 的提取

按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3.2 PCR 擴(kuò)增

以分離菌株提取的基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，70 ℃延伸50 s，72 ℃末端延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

2.3.3 PCR 目的片段回收

按照AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒說明書操作。

2.3.4 PCR 目的片段的測序及序列分析

將回收的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物連接T 載體送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將測序結(jié)果輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫，利用Blast 軟件，與數(shù)據(jù)庫中已測出的基因序列進(jìn)行序列比對。

2.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用最大節(jié)約方法考察數(shù)據(jù)組中序列的多重比對結(jié)果，優(yōu)化出的進(jìn)化樹能夠利用最少的離散步驟去解釋多重比對中的堿基差異。實(shí)驗(yàn)通過綜合使用clustalx1.83、BioEdit7.0、Mega 4.1 三種軟件對分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，描繪分離株與其他菌株的親緣關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

分離菌株呈桿狀，以長性、細(xì)長型、彎曲形和短粗狀等多形態(tài)存在，細(xì)菌以單個(gè)、成對、短鏈狀、呈簇及分散狀等方式排列，如圖1。MRS 固體培養(yǎng)基上，分離菌株主要呈邊緣整齊、表面光滑、中央有凸起或扁平的白色菌落，或者邊緣不整齊、表面粗糙無光澤和中央有凸起或扁平的褐色或乳黃色菌落，在菌落的周圍可看到光亮的菌圈，該分離株命名為helsc。

圖1 分離株helsc 的染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Result of staining and microscopic examination

3.2 分離株helsc 的PCR 檢測結(jié)果

分離株helsc 的PCR 檢測結(jié)果，通過PCR 擴(kuò)增獲得1 200 bp 左右的目的片段，結(jié)果如圖2。

圖2 分離株helsc16SrRNA 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of 16SrRNA gene

3.3 分離株helsc 的序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

分離株16SrRNA 基因序列與GenBank/EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫中序列Blast 結(jié)果顯示，與乳酸桿菌的同源性超過97%，故可確定其為乳酸桿菌屬。利用Mega4.0 做系統(tǒng)進(jìn)化樹，比較相關(guān)菌株序列之間的親緣關(guān)系，從圖3 中可知，helsc 和Lactobacillus plantarum strain H2（Lactoba15）在系統(tǒng)位置上最近，親緣關(guān)系較近，分離株序列和Lactobacillus plantarum strain H2 的同源性達(dá)到97%，從而確定該分離株為植物乳桿菌。

4 討論

酸菜是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜制品，主要由乳酸菌發(fā)酵而制成。近年來隨著人們對乳酸菌及乳酸生物功能和保健功能認(rèn)識的提高，酸菜也被越來越多的人們所喜愛。酸菜中富含維生素A、B、C 等重要的維生素和多種礦物質(zhì)，是一種既安全又營養(yǎng)的蔬菜發(fā)酵制品[7]。酸菜發(fā)酵是乳酸桿菌分解白菜中糖類產(chǎn)生一種能夠直接被人體所吸收的有機(jī)酸——乳酸的結(jié)果。乳酸被人體吸收后可刺激消化腺分泌消化液幫助消化增進(jìn)食欲，能抑制大腸內(nèi)腐敗菌類的繁殖減少毒素的產(chǎn)生，并吞噬致癌物質(zhì)，能有效的防止結(jié)腸癌、直腸癌等。

圖3 Helsc 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Result of helsc evolution tree

試驗(yàn)以自然發(fā)酵的東北酸菜為對象，進(jìn)行了乳酸菌的分離鑒定。采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，在分離株為乳酸菌的基礎(chǔ)上，從基因水平上進(jìn)行鑒定分類，著重進(jìn)行了16SrRNA 序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而確定其為植物乳桿菌。

現(xiàn)代微生物學(xué)的發(fā)展，揭示了乳酸菌對人體健康有益作用的機(jī)理，也使得具有營養(yǎng)保健作用的乳酸菌發(fā)酵食品更加受到消費(fèi)者的喜愛。乳酸菌不僅可以提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，改善食品的風(fēng)味，提高食品的價(jià)值和保藏性[8]，而且，近年來，乳酸菌的特殊生理活性和營養(yǎng)功能，正日益引起人們的重視，尤其是近年來在降低膽固醇作用方面進(jìn)行了初步的研究[9-10]。試驗(yàn)對自然發(fā)酵的酸菜進(jìn)行乳酸菌的分離鑒定，接下來要對該菌的特性和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為將來從事酸菜的純菌發(fā)酵和工廠化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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