配位體交換色譜法分析果葡糖漿中的單糖

賈鵬禹，孫蕊，何冬亮，黃學(xué)英

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶 163319；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院;3. 蘇州賽分科技有限公司）

果葡糖漿也稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿，是以酶法糖化淀粉所得的糖化液經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖組成的混合糖糖漿，其應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛[1]。F42果葡糖漿（一代，果糖含量42%）中的葡萄糖含量較高，果糖含量較低，不足以滿足醫(yī)療和保健的需要，并且低溫時易結(jié)晶，不便貯存。因此提高果葡糖漿中果糖含量，生產(chǎn)F55果葡糖漿（二代，果糖含量55%）和F90果葡糖漿（三代，果糖含量90%）是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)需求[2]。未來幾年，模擬移動色譜技術(shù)（SMB）將成為推動此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步的主要動力[3-5]。

一般性樣品中單糖的高效液相色譜分析方法多采用正相色譜柱的反相洗脫模式（氨基柱-乙腈/水）[6]，此方法乙腈消耗極大、非環(huán)境友好方法；也可采用柱前衍生化反相液相色譜法，但處理較復(fù)雜，多適用于復(fù)雜基體中單糖檢測[7-8]。配位體交換色譜法（ligand exchange chromatography）即依靠含有金屬離子配體的離子交換樹脂對糖組分交換勢的差異，從而得到分離，樣品無需衍生化處理，大多可直接上樣，穩(wěn)定性優(yōu)越。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：1200 美國Agilent 公司），配備：G1310A 四元梯度泵、G1362A 示差折光檢測器、G1329A 恒溫自動進(jìn)樣器、G1322A 在線脫氣機(jī)、G1316A 柱溫控制單元、chemstation 色譜工作站；電子分析天平（型號：ML104 瑞士梅特勒公司）；pH計(jì)；手持式電導(dǎo)率儀。

1.2 試劑、實(shí)驗(yàn)材料

果糖、葡萄糖（分析純）。實(shí)驗(yàn)所用乙腈為色譜純、水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純試劑；果葡糖漿（F42）由黑龍江昊天科技有限公司提供，F(xiàn)55和F90由F42經(jīng)八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品檢測中心實(shí)驗(yàn)室SMB 裝置純化制得。

1.3 樣品前處理與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

取果葡糖漿樣品2 mL 用純水稀釋后定容至100 mL，上機(jī)樣經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾進(jìn)行HPLC分析。

精密稱取葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品用水定容至100 mL 溶液，各配制成5、25、50、75、100 mg·mL-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾進(jìn)行HPLC 分析，以各濃度對應(yīng)峰面積做回歸方程。保留時間定性，外標(biāo)法、面積歸一化法定量。

1.4 HPLC 條件

色 譜 柱：Sepax Carbomix Pb -NP10 （300 ×7.8 mmID，10 μm，8%交聯(lián)度，PN：241008-7830），配同系保護(hù) 柱Carbomix Pb-NP10 （50×7.8 mmID，10 μm，8%交聯(lián)度，PN：241008-7805）；流動相：純水；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：80 ℃；示差檢測器溫度：30 ℃，響應(yīng)時間：6 s；進(jìn)樣量：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法適應(yīng)性與糖配位體交換色譜分離機(jī)制

由圖可見，圖1（a）標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中葡萄糖和果糖分別在15 min 和22 min 處洗脫；圖1（b）中F42樣品全部組分分離在30 min 內(nèi)完成，目標(biāo)峰位無干擾。

圖1 葡萄糖和果糖標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Sample chromatograms of Glucose and fructose

配位體交換色譜法所用分析柱填料多采用基于配體交換作用的聚合物樹脂，如圖2 所示，配體交換樹脂是高度磺化的陰離子交換樹脂，帶有1，2 族或過渡金屬元素，樹脂上的磺酸基團(tuán)通過離子吸引力將金屬離子緊緊吸附于柱上而不會被洗脫。單糖的配體交換分離機(jī)制：糖分子（如葡萄糖）上每一個羥基都帶有一個非常弱的負(fù)電荷，而端基異構(gòu)碳上所帶的羥基可被去質(zhì)子化，從而帶上一個很強(qiáng)的負(fù)電荷，糖分子上的這些負(fù)電荷與樹脂表面上的金屬離子的正電荷之間的相互作用使糖被保留，由保留的差異從而達(dá)到分離。

2.2 色譜柱的選擇

配位交換分配形式的固定相是4%～10%交聯(lián)的聚苯乙烯磺酸鹽，通常用純水作流動相。配位體交換色譜柱分離的選擇性要通過選擇樹脂類型、樹脂上絡(luò)合金屬元素類型（抗衡離子）、柱溫和流動相等條件來控制，一般狀況下，針對不同組分選擇合適的抗衡離子是決定分離的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)考察了抗衡離子為鈣離子（Ca2+）和鉛離子（Pb2+）兩種填料對果葡糖漿中單糖分離的影響，發(fā)現(xiàn)鉛（Pb2+）柱對分離多種單糖更具優(yōu)勢，具有較好的分離度，因此實(shí)驗(yàn)采用鉛（Pb2+）柱分離；另外考慮到分離柱運(yùn)行壓力的耐受性，實(shí)驗(yàn)選擇了剛性更強(qiáng)的高交聯(lián)度樹脂，交聯(lián)度為8%。

圖2 色譜柱填料與配體交換的分離機(jī)制Fig.2 Separation mechanism of M-PS/DVB HPLC packing and ligand exchange

2.3 色譜分離的改善與優(yōu)化

配位體交換在進(jìn)行糖混合物分離時，水（流動相）與柱上金屬離子間也存在非常弱的離子吸引力，用水作為流動相來競爭洗脫被吸附住的糖，這樣的吸附解附貫穿于整個分離過程[9]。如圖2 所示，在洗脫過程中糖與流動相共同爭奪吸附在樹脂上的金屬離子，由于各種糖與金屬離子形成絡(luò)合物能力的不同，即產(chǎn)生了分離?；诹鲃酉鄬M分洗脫能力的可調(diào)性，故在流動相中加入10%～20%的乙腈即可分離。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入少量乙腈（V水/V乙腈=95∶5）的流動相可大大抑制溶劑系統(tǒng)中菌的產(chǎn)生，保證色譜柱的使用壽命，延長保存時間，而不必購買劇毒疊氮化鈉抑菌劑。

常溫條件下配位交換分離結(jié)構(gòu)類似的糖，其分辨率和柱效并不好，所以這種分離形式常在較高溫度（一般80 ℃）下進(jìn)行，溫度提高降低了流動相的粘度，使得運(yùn)行壓力較低，對于剛性較差的聚合物基質(zhì)的色譜柱有利；另外柱溫提高可以避免糖發(fā)生旋光現(xiàn)象[10]。

2.4 樣品前處理

配體交換分離的色譜柱內(nèi)抗衡離子是色譜分離的關(guān)鍵，抗衡離子的流失和改變會嚴(yán)重影響柱效，因此在采用配體交換分離之前要嚴(yán)格考察樣品，如樣品來源、電導(dǎo)率、樣品pH 值、有機(jī)溶劑含量、含醇量及重金屬離子等。實(shí)驗(yàn)對上述參數(shù)進(jìn)行了測試，可作為配體交換色譜樣品前處理中樣品考察的一般流程，見表1。

表1 樣品評估流程Table 1 The process of sample investigation

2.5 方法精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

實(shí)驗(yàn)考察了方法精密度，取混標(biāo)樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各組分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，葡萄糖和果糖的精密度（RSD，n=6）分別為：0.63%和0.76%；對兩種單糖進(jìn)行線性范圍考察；根據(jù)峰面積A 對單糖濃度C（mg·L-1）進(jìn)行線性回歸，依據(jù)三倍噪聲計(jì)算檢測限。結(jié)果見表2。

表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equations

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)際樣品中定量加入混標(biāo)的方式進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，采用外標(biāo)法定量，測得單糖平均回收率在98.3%～102.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.41%～0.83%。

2.7 樣品測試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用歸一化定量方法對6 個不同批次的F42、F55、F90型果葡糖漿中葡萄糖和果糖含量進(jìn)行了檢測。不同批次所得各單糖平均值（ω/ω）見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Table 3 Test results of samples

3 小結(jié)

通過配位體交換示差折光檢測器高效液相色譜實(shí)現(xiàn)了果葡糖漿中的葡萄糖和果糖含量的測定，方法簡便普適，重現(xiàn)性好，測試成本低廉；此法可為果葡糖漿（F42、F55、F90）生產(chǎn)工藝的控制提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。但此法受示差檢測器靈敏度的局限性制約，采用靈敏度更高的蒸發(fā)光散射作為檢測器配置將使得整體解決方案更為出色。

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