多年生藤本豆與大豆中黃酮類化合物體外抗氧化活性比較研究

趙丹丹，鄭鴻雁

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，吉林長春130118）

多年生藤本豆，是經(jīng)過多年研究培植出來的新型蔬菜類新品種[1]。多年生藤本豆是綠色生態(tài)抗逆性品種，可在0～42℃無休眠期生長，甚至能在其他農(nóng)作物不能生長的貧脊土地上頑強(qiáng)存活。北方每公頃土地可產(chǎn)10萬公斤鮮豆角，其畝產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆，具有很大的開發(fā)與利用價(jià)值。同時(shí)，多年生藤本豆含有優(yōu)質(zhì)的卵磷脂、蛋白質(zhì)、纖維等，其中的多肽還具有保健功能[2]。大豆（Glycine max），是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物[3]，目前國內(nèi)對(duì)大豆的研究成果頗多，但從多年生藤本豆中提取黃酮類化合物并進(jìn)行體外抗氧化的研究尚無報(bào)道。通過對(duì)大豆和多年生藤本豆黃酮提取液抗氧化活性進(jìn)行比較，從而對(duì)多年生藤本豆的進(jìn)一步開發(fā)、利用和推廣提供參考。黃酮類化合物在植物葉片和果實(shí)中大部分與糖結(jié)合成苷類的形式存在，已發(fā)現(xiàn)有5000余種植物含有該物質(zhì)[4]。黃酮類化合物在生物體內(nèi)可協(xié)同維生素及體內(nèi)酶起到抗過敏、抗病毒、防止心血管疾病及清除自由基的作用[5]，同時(shí)還有抗炎癥、抗?jié)兗案闻K排毒的功效[6-9]。從豆類中提取黃酮類化合物可以添加至保健品中發(fā)揮藥用價(jià)值，從而一定程度上減少了黃酮類物質(zhì)添加制成的保健品和藥品的加工成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多年生藤本豆 由長春市昌達(dá)天然植物開發(fā)有限公司提供；大豆 吉林48號(hào)，由吉林省農(nóng)科院大豆所育成，購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、H2O2、抗壞血酸（VC）、石油醚、二丁級(jí)羥基甲苯（BHT，食品級(jí)）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷（Tris）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純；以下用水除特殊說明外 均為GB/T 6682-2008中規(guī)定的三級(jí)水。

JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1700 pharmaspec紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海榮亞生化儀器；微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[10]分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6個(gè)10.0mL容量瓶中，分別加30%乙醇溶液至5.0mL。而后各加5%亞硝酸鈉溶液0.4mL，搖勻后靜置5min。再加入10%硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻后靜置6min。最后加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液4.0mL，用30%乙醇定容至容量瓶刻度。所得蘆丁與鋁鹽生成的紅色絡(luò)合物在356nm波長下進(jìn)行掃描測(cè)得吸光度值，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=23.65x+0.0517，R2=0.9996。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.2 黃酮粗提物的制備 原料經(jīng)過干燥、粉碎、過篩（40目）等預(yù)處理后準(zhǔn)確稱取10g，用石油醚為溶劑索氏抽提回流4h除去色素和脂類雜質(zhì)，揮干石油醚。采用乙醇超聲輔助提取法提取黃酮類化合物，提取條件為：70%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間30min，超聲功率400W，料液比為1∶15。所得濾液經(jīng)過濾、減壓蒸餾的濃縮物進(jìn)行真空冷凍干燥48h，得到粗黃酮提取物，備用。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定參考NaNO2-Al（NO3）3比色法準(zhǔn)確吸取2.0mL的提取液加入10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4mL，搖勻后靜置5min；分別加入10%硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻靜置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液4.0mL，用30%乙醇溶液定容到刻度，在波長356nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物總黃酮的含量。

1.2.4 多年生藤本豆和大豆中黃酮類組分總還原能力的測(cè)定 分別加入pH6.6的PBS緩沖液2.5mL、1g/100mL鐵氰化鉀溶液1mL、不同質(zhì)量濃度提取樣液1mL于試管中，搖勻后置于50℃水浴鍋中加熱20min，待冷卻后再加入10g/100mL三氯乙酸2.5mL并搖勻，吸取2mL于另一只試管中，并加入蒸餾水5mL和1g/100mL三氯化鐵1mL，混勻后靜置10min，于700nm處測(cè)定反應(yīng)體系的OD值，以蒸餾水作參比，VC作為對(duì)照樣品，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后求得平均值，繪制總還原能力變化曲線[11]。

1.2.5 多年生藤本豆和大豆中黃酮類組分清除超氧自由基的能力 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取pH8.2，0.05mol/L Tris-HCl緩沖液5mL于試管中，加蒸餾水4.5mL，置于25℃水浴鍋中保溫20min后立即加入3mmol/L鄰苯三酚0.5mL，充分搖勻，于299nm波長處測(cè)定OD值，以加入鄰苯三酚后的瞬間開始計(jì)時(shí)，每隔1min記錄一次吸光度（Ao），持續(xù)記錄10min，以蒸餾水作參比，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘OD值的增加值（Vo）。

多年生藤本豆和大豆總黃酮清除超氧陰離子能力的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取pH8.2，0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液5mL于試管中，加H2O 5mL，不同質(zhì)量濃度的樣液2mL，充分搖勻，于299nm波長處測(cè)定OD值，以加入鄰苯三酚溶液后的瞬間開始計(jì)時(shí)，每隔1min記錄一次OD值，持續(xù)記錄10min，以蒸餾水調(diào)零，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘OD值的增加量（Vm）。以VC作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后求平均值，按照式（1）計(jì)算總黃酮對(duì)超氧自由基的清除率。

1.2.6 多年生藤本豆和大豆中黃酮類組分清除·OH的能力 在試管中依次加入6mmol/L FeSO4溶液2mL、6mmol/L H2O22mL及不同質(zhì)量濃度的提取樣液1mL，搖勻后靜置10min，再加入6mmol/L水楊酸2mL，于37℃的水浴中反應(yīng)30min后，在510nm波長處測(cè)定其OD值（Ai），蒸餾水代替水楊酸測(cè)定OD值（Ax），蒸餾水代替樣液測(cè)定OD值（Ao）。以VC和BHT做為對(duì)照樣品，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，求得平均值，按照式（2）計(jì)算總黃酮對(duì)·OH的清除率。

1.2.7 多年生藤本豆和大豆中黃酮類組分清除DPPH自由基的能力 準(zhǔn)確稱取0.0079g DPPH試劑，用無水乙醇定容至100mL，配制成20μmol/L DPPH溶液。取20μmol/L DPPH溶液2mL、樣品溶劑2mL、無水乙醇1mL于試管中，反應(yīng)30min后于517nm波長處測(cè)定OD值（A0）；取20μmol/L DPPH溶液2mL、樣品溶液（對(duì)照樣品）2mL、無水乙醇1mL于試管中，反應(yīng)30min后于517nm波長處測(cè)定OD值（Ai）；取無水乙醇2mL、樣品溶液（對(duì)照樣品）2mL、無水乙醇1mL于試管中，反應(yīng)30min后于517nm波長處測(cè)定OD值（Aj）；以無水乙醇調(diào)零，VC作為對(duì)照樣品，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次后求平均值，按照式（3）得DPPH自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多年生藤本豆和大豆黃酮類化合物的還原能力測(cè)定

如圖2結(jié)果所示，多年生藤本豆和大豆黃酮類化合物提取樣液都具有一定的還原能力，其還原能力與樣液中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度呈一定的線性關(guān)系；樣液在0～3.0mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著樣液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增大，其還原能力呈逐漸增大趨勢(shì)，多年生藤本豆、大豆與VC還原能力存在顯著性差異（p＜0.05），多年生藤本豆與大豆還原能力存在顯著差異（p＜0.05），多年生藤本豆與大豆的還原能力在實(shí)驗(yàn)參考范圍內(nèi)弱于VC。

圖2 多年生藤本豆和大豆中黃酮類化合物與VC的還原能力Fig.2 Total reducing power of total flavonoids from perennial Fujimoto Zu and Glycine max and VC

2.2 對(duì)超氧自由基的清除效果

鄰苯三酚在堿性溶液中發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，多年生藤本豆和大豆提取樣液中含有的黃酮類化合物可以抑制超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，根據(jù)該原理可以測(cè)定OD值的變化得到多年生藤本豆和大豆中黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[12]。

圖3 多年生藤本豆和大豆中黃酮類化合物與VC清除O2-·自由基的效果Fig.3 Scavenging capacity of total flavonoids from perennial Fujimoto Zu and Glycine max and vitamin C against superoxide anion free radicals

如圖3結(jié)果所示，多年生藤本豆和大豆黃酮類化合物提取液在0.05～0.25mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子具有清除作用；清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)呈線性關(guān)系，多年生藤本豆與大豆清除O2-·自由基的能力在實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)存在顯著性差異（p＜0.05），多年生藤本豆、大豆與VC清除O2-·自由基的能力的存在差異。

2.3 對(duì)羥自由基的清除效果

H2O2與Fe2+反應(yīng)可產(chǎn)生氧化性較強(qiáng)的·OH自由基，加入水楊酸后體系內(nèi)產(chǎn)生有色產(chǎn)物2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在波長510nm處有最大吸收[13]。多年生藤本豆和大豆提取樣液中含有抗氧化活性的黃酮類化合物，加入反應(yīng)體系后可以抑制2，3-二羥基苯甲酸的產(chǎn)生，從而達(dá)到清除·OH自由基的效果。抗氧化劑2，6-二叔基對(duì)甲苯酚（BHT）能夠延遲食物的酸敗，故多作為食品添加劑添加至食品中，本實(shí)驗(yàn)比較多年生藤本豆和大豆對(duì)VC和BHT兩種抗氧化劑的氧化活性抑制作用。

圖4 多年生藤本豆和大豆總黃酮與VC和BHT對(duì)·OH自由基的清除效果Fig.4 Scavenging capacity of total flavonoids from perennial Fujimoto Zu and Glycine max to vitamin C and BHT against hydroxyl free radicals

如圖4結(jié)果所示，多年生藤本豆和大豆黃酮類化合物提取液在0.1～0.5mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)·OH自由基的清除率呈線性關(guān)系；黃酮類化合物提取液質(zhì)量濃度從0.1mg/mL增加到0.5mg/mL時(shí)，VC、大豆、多年生藤本豆、BHT對(duì)·OH自由基的清除率分別從78.95%、70.72%、69.91%、63.06%增加為93.04%、84.87%、83.82%、75.56%，在相同質(zhì)量濃度，多年生藤本豆、大豆、BHT與VC清除·OH能力呈顯著差異（p＜0.05），多年生藤本豆與大豆清除·OH能力在實(shí)驗(yàn)考察范圍內(nèi)略強(qiáng)于BHT，存在差異顯著性（p＜0.05）。

2.4 對(duì)DPPH自由基的清除效果

DPPH-比色法主要利用自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH自由基的孤對(duì)電子配對(duì)后使反應(yīng)溶液由紫色變?yōu)辄S色[14-15]，在517nm波長處，隨著清除時(shí)間的延長，溶液的OD值隨即減小，顏色變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)，吸光度越小。

圖5 多年生藤本豆和大豆總黃酮與VC對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.5 Scavenging capacity of total flavonoids from perennial Fujimoto Zu and Glycine max and vitamin C against DPPH free radicals

由圖5可知，多年生藤本豆和大豆黃酮類化合物提取液在0.2～0.6mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系；提取樣液質(zhì)量濃度由0.2mg/mL增加至0.6mg/mL時(shí)，VC、大豆、多年生藤本豆對(duì)DPPH自由基的清除率分別從83.05%、78.81%、75.76%增加至94.36%、87.46%、86.19%；樣液中的黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基的清除率能力呈緩慢增加趨勢(shì)，多年生藤本豆、大豆與VC對(duì)DPPH自由基的清除效果在考察范圍內(nèi)存在顯著差異（p＜0.05）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定樣品中黃酮類化合物對(duì)體外產(chǎn)生的自由基系統(tǒng)的清除率，進(jìn)而比較了多年生藤本豆與大豆抗氧化活性。在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多年生藤本豆的還原能力及對(duì)超氧自由基、·OH自由基、DPPH自由基清除能力弱于大豆，呈顯著性差異（p＜0.05），多年生藤本豆、大豆與VC清除能力呈顯著差異性（p＜0.05）。結(jié)果表明，多年生藤本豆中的黃酮類化合物可發(fā)揮抗氧化活性，多年生藤本豆與大豆的抗氧化活性呈顯著差異（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)研究多年生藤本豆中黃酮類化合物的抗氧化活性，為其今后的綜合利用及提取物的活性研究提供理論依據(jù)。

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