蛋白水解酶聯(lián)合自溶作用的南極磷蝦多肽氨基酸分析

倪 玲，吳文惠，2，張 啟，謝 晶，包 斌，2，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306）

南極磷蝦（Euphausia superba）廣泛分布于南極水域，2005～2006年計(jì)劃捕撈南極磷蝦產(chǎn)量為24.5萬t[1-2]，作為一種新的海洋生物資源因其巨大的生物量和潛在的漁業(yè)價(jià)值（最新估計(jì)量為6.5～10億t）受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。對(duì)于當(dāng)前國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)蛋白資源日趨匱乏的現(xiàn)狀，南極磷蝦蛋白質(zhì)作為優(yōu)質(zhì)蛋白資源，開發(fā)利用南極磷蝦蛋白無疑是滿足人類需求的重要途徑[3-5]。南極磷蝦具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)量屬性，除了作為高價(jià)值飼料受到關(guān)注以外，在食品工業(yè)和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑領(lǐng)域也日益受到重視[3，6]。南極磷蝦直接干燥獲得的南極磷蝦粉被認(rèn)為含有優(yōu)良的蛋白質(zhì)、富含β-胡蘿卜素、優(yōu)質(zhì)脂類、礦物質(zhì)、甲殼素和殼聚糖成分等，具有很強(qiáng)的適口性，特別是南極磷蝦粉中只含有極微量的二噁英、多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyls，PCB）和重金屬這一特征使其成為不可替代的飼料原料[7]。南極磷蝦的營(yíng)養(yǎng)成分分析表明[8-9]，肌肉中含有約78%的蛋白質(zhì)，8%的脂肪，約27%的脂肪屬于多不飽和脂肪酸。含有18種常見氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸（Essential aminoacid，EAA），氨基酸總量（Total amino acid，TAA）為57.21%，其中必需氨基酸含量為25.88%，其構(gòu)成比例符合FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)[2，8]，18種水解氨基酸中，谷氨酸含量最高10.90%，賴氨酸含量次之5.93%，其余含量較高的還有丙氨酸、亮氨酸。色氨酸含量最低，只占氨基酸總量的1.38%。本文研究了伴隨自溶作用的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解南極磷蝦肌肉的特性，以期獲得氨基酸構(gòu)成比例不同的富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的南極磷蝦多肽（Antarctic Krill Enzymen-Resoliution With Autolysis Peptide，AKERAP）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦（Antarctic Krill） 青島?？êＱ笊锟萍加邢薰咎峁?；試劑 國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 二次蒸餾用水；

全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；2300KJELTEC凱氏定氮儀 丹麥FOSS；CR21G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi；Tanon-4100凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以酶解溫度（25、37、49℃）、酶解時(shí)間（2、8、14h）和蛋白水解酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件。設(shè)計(jì)L9（33）正交實(shí)驗(yàn)。通過之前的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表，因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in L9（33）orthogonal array design

通過勻漿制備的南極磷蝦勻漿液，在加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行L9（33）實(shí)驗(yàn)過程中，伴隨著南極磷蝦組織細(xì)胞破裂其自溶酶如胰蛋白酶[13]的自溶作用。

1.2.2 AKERP的制備 準(zhǔn)確稱取冷凍南極磷蝦20g置于1000mL燒杯中，加入磷酸鹽緩沖液（50mmol/L）100mL勻漿，用6.0mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)至木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的最適pH分別是pH8.0、pH8.0和pH2.0，分別加入蛋白水解酶（胃蛋白酶占南極磷蝦重的0.05%、胰蛋白酶占南極磷蝦重的0.1%、木瓜蛋白酶占南極磷蝦重的0.1%），在所需條件水解后于5000r/min離心10min，取上清液供測(cè)試分析。胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力分別是1200、5000、6000u/mg。

1.2.3 南極磷蝦多肽含量（以粗蛋白的量計(jì)）的測(cè)定

參考自動(dòng)凱氏定氮儀檢測(cè)粗蛋白的方法[10]。各取5mL樣品加入基爾特克250mL消化管中，分別加入硫酸15mL、硫酸鉀5.0g、硫酸銅0.5g，在450℃下消化3h，冷卻，用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)總的含氮量，根據(jù)氮換算為蛋白質(zhì)的平均系數(shù)6.25計(jì)算得出粗蛋白的量。

1.2.4 SDS-PAG電泳 參考SDS-PAGE方法對(duì)1.2.3所得上清液進(jìn)行電泳[11]，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為3%，電極緩沖液為SDS-Tris-甘氨酸，電泳電流25mA，電壓600V，電泳時(shí)間為1.5～2h.計(jì)算酶解多肽的分子量，并用凝膠成像儀分析不同分子量的酶解多肽的相對(duì)百分含量。

1.2.5 氨基酸分析 采用氨基酸分析方法[12]，精確量取樣品1mL（1mg/mL），轉(zhuǎn)入置于100℃水浴10mL的水解管中，加入溫度為100℃的7.5mol/L的優(yōu)級(jí)純鹽酸4mL，迅速旋緊試管蓋。然后將試管放在110℃的干熱箱中保溫24h。取出試管冷卻至室溫，用6mol/L的NaOH中和至中性，過濾，濾液用去離子水加至20mL（作為a液）。取a液400μL用0.02mol/L的優(yōu)級(jí)純鹽酸稀釋到2000μL，此時(shí)樣品終濃度約為2nmol/20μL。經(jīng)0.54nm濾膜過濾得到氨基酸分析用樣品，用氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸組成，分析各樣品的氨基酸含量。在堿解條件下測(cè)定了色氨酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度的優(yōu)化 選取胰蛋白酶，酶解溫度分別為25、37、49℃酶解南極磷蝦，測(cè)定其多肽含量。從圖1中可以分析得出，酶解的溫度在37℃時(shí)，南極磷蝦的多肽量達(dá)到最大，明顯高于其他兩個(gè)酶解溫度的多肽量。

圖1 溫度對(duì)南極磷蝦多肽量的影響Fig.1 Effect of different temperature of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.1.2 酶解時(shí)間的優(yōu)化 選取胰蛋白酶，酶解時(shí)間分別為2、8、14h，測(cè)定酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦多肽量的影響。從圖中可以得出酶解的最佳時(shí)間為8h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦多肽量的影響Fig.2 Effect of different time of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.1.3 蛋白水解酶的選擇 選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在37℃條件下酶解8h，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明胰蛋白酶對(duì)南極磷蝦的酶解得到的南極磷蝦多肽含量最高，明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。由于三種蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解產(chǎn)生的多肽分子量也就不同，綜上，正交實(shí)驗(yàn)選擇了三種蛋白酶設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶的種類對(duì)南極磷蝦多肽量的影響Fig.3 Effect of different enzyme of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.2 不同處理?xiàng)l件對(duì)南極磷蝦多肽含量的影響結(jié)果

使用凱氏定氮儀，按照1.2.3的方法，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的9個(gè)樣品（表2）利用凱式定氮儀測(cè)定粗蛋白量，以南極磷蝦多肽的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如表2和圖4所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment for L9（33）

從表2可以看到，處理樣品的南極磷蝦多肽（以粗蛋白含量計(jì)）濃度在15.21～21.79mg/mL的范圍。蛋白水解酶處理的極差最大，溫度處理的極差最小，影響粗蛋白含量的3個(gè)因素的重要性依次為A＞B＞C。最佳組合為A2B3C3。即：使用胰蛋白酶，培養(yǎng)溫度45℃，水解12h。

以表2為基礎(chǔ)，進(jìn)行了蛋白水解酶、處理時(shí)間、處理溫度對(duì)南極磷蝦多肽含量影響的方差分析。通過方差分析可得，蛋白水解酶因素對(duì)南極磷蝦多肽數(shù)量的影響最大。

在南極磷蝦多肽制備過程中勻漿液的固體數(shù)量逐漸減少，在不同正交實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件下酶解多肽液的顏色和氣味不同，其中實(shí)驗(yàn)號(hào)7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）的顏色較深，初步認(rèn)為在45℃比較適宜的酶作用溫度下存在于肌組織蛋白質(zhì)中的蝦青素因蛋白質(zhì)酶解而被釋放出來，在本實(shí)驗(yàn)的條件下蝦青素從無色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚垢髅附庖撼尸F(xiàn)出程度不同的褐色，特別是被木瓜蛋白酶處理的樣品水解程度較大。

在加熱和酶解的條件下，南極磷蝦中的呈味小分子化合物（可能是琥珀酸或乳酸）被釋放出來[14-16]，呈現(xiàn)南極磷蝦特有的氣味。正交實(shí)驗(yàn)處理樣品的多肽含量與其他學(xué)者的研究結(jié)論相似[14]。

2.3 電泳分析

將上述正交實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀分析正交實(shí)驗(yàn)9個(gè)樣品中不同分子量的酶解多肽（圖4），每條多肽條帶占整條泳帶的相對(duì)百分含量如表3所示。

圖4 南極磷蝦多肽的SDS-PAGEFig.4 Enzymatic Hydrolysate electrophoresis of Antarctic krill hydrolyzate

圖5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的線性關(guān)系Fig.5 Linear relation on molecular weight related mobility of marker

從圖4可以看到，正交實(shí)驗(yàn)處理樣品的南極磷蝦多肽種類不同，用胰蛋白酶處理的樣品南極磷蝦多肽種類（條帶）最多，胃蛋白酶處理的樣品次之，木瓜蛋白酶處理的樣品最少。從條帶的深淺上也體現(xiàn)出胰蛋白酶處理的樣品深于胃蛋白酶、胃蛋白酶處理的樣品，這說明胰蛋白酶處理的樣品含有的南極磷蝦多肽的量較高。正交實(shí)驗(yàn)處理樣品的南極磷蝦多肽最多為18種（條帶），其分子量分別為143.8（a）、110.9（b）、77.6（c）、68.3（d）、61.8（e）、57.9（f）、52.6（g）、49.3（h）、45.2（i）、40.5（j）、33.4（k）、30.7（l）、26.6（m）、22.6（n）、19.6（o）、16.3（p）、14.3（q）、11.1（r）ku。

由圖4和表3可知，樣品4（A2B1C2）、5（A2B2C3）、6（A2B3C1）的南極磷蝦酶解液中的南極磷蝦多肽的分子量在11.1～143.8ku較多，其中樣品6最多，占整條泳帶的57.60%，樣品1（A1B1C1）、2（A1B2C2）、3（A1B3C3）次之，樣品7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）中最少。在所有樣品中分子量49.3ku以下的多肽分子占大部分，在樣品5（A2B2C3）中分子量11.1～49.3ku的多肽分子約占多肽分子總量64.36%，同樣，在樣品6（A2B3C1）中占68.01%，這說明南極磷蝦肌肉蛋白的胰蛋白酶酶解效果較好。但是在樣品4 （A2B1C2）、5（A2B2C3）、6（A2B3C1）、7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）的泳帶中，分子量較大的a條帶較難水解，但在樣品1（A1B1C1）、2（A1B2C2）、3（A1B3C3）中卻沒有出現(xiàn)，這可能與所加的酶有關(guān)，說明胃蛋白酶可水解分子量較大的a蛋白。SDS-PAGE和水解短肽的結(jié)果表明木瓜蛋白酶對(duì)南極磷蝦肌肉蛋白的水解程度最大。

表3 南極磷蝦多肽電泳條帶的相對(duì)含量Table 3 Results of electrophoresis gel of the Antarctic krill hydrolyzate

2.4 氨基酸分析及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

由于不同的蛋白酶水解多肽含有的多肽種類不同。選取樣品2（A1B2C2）、5（A2B2C3）、7（A3B1C3）、9（A3B3C2）及優(yōu)化組合A2B3C3五個(gè)樣品，分析了AKERP的常見氨基酸的種類和數(shù)量，其中2（A1B2C2）、5（A2B2C3）、7（A3B1C3）、9（A3B3C2）代表三種不同蛋白水解酶水解南極磷蝦得到多肽含量較高的樣品，優(yōu)化組合A2B3C3為最佳酶解條件下獲得的南極磷蝦多肽酶解液。結(jié)果如表4和圖6所示。

由表4可知，南極磷蝦酶解氨基酸共測(cè)得18種常見氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）；10種非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA）。氨基酸數(shù)量（Total amino acid，TAA）最高的是最優(yōu)酶解條件下（A2B3C3）獲得的南極磷蝦酶解多肽溶液樣品。南極磷蝦多肽中含量最高的氨基酸是谷氨酸，其次是甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。

不同處理?xiàng)l件下，胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸的數(shù)量變化比較大，其他氨基酸在不同處理間變化較小。具有廣泛酶切位點(diǎn)的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶與作用位點(diǎn)在賴氨酸和精氨酸之間的胰蛋白酶相比，在自溶作用存在的條件下，南極磷蝦多肽的氨基酸組成沒有規(guī)律性。

圖6 南極磷蝦多肽的氨基酸模式圖Fig.6 Amino acid patternof polypeptide from Antarctic krill

根據(jù)FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式認(rèn)為，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其氨基酸組成EAA/TAA在40左右，EAA/NEAA在60以上。由圖6得知，樣品A1B2C2、A2B2C3、A3B1C3、A2B3C3、A3B3C2的南極磷蝦多肽的EAA/TAA分別為為39、40、40、41和40，EAA/NEAA分別為為64、67、65、68和68，該結(jié)果表明南極磷蝦多肽不僅含有豐富的必需氨基酸，而且必需氨基酸之間的比例適宜，有利于人體吸收。

3 結(jié)論與討論

南極磷蝦作為海洋優(yōu)質(zhì)蛋白資源，其高值化利用和規(guī)模化加工都有待進(jìn)行深入探索和研究，南極磷蝦肌肉蛋白的應(yīng)用生物化學(xué)特性、南極磷蝦蛋白的分離方法和利用途徑以及南極磷蝦蛋白的食用安全性都是南極磷蝦利用過程中亟待解決的理論問題和實(shí)際問題[17-18]，本文針對(duì)南極磷蝦的利用從磷蝦肌肉蛋白水解的角度進(jìn)行了有益的探索。

表4 南極磷蝦多肽樣品的氨基酸分析表Table 4 Comparison of amino acids in enzymatic hydrolysate of Euphausia superba

正交實(shí)驗(yàn)以水解固形物、南極磷蝦多肽、氨基酸特征為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)得出蛋白水解酶聯(lián)合自溶作用水解南極磷蝦肌肉蛋白的最佳條件為使用胰蛋白酶在溫度45℃的條件下水解12h，獲得的AKERP的分子量為11.1～49.3ku的南極磷蝦多肽所占比例較大。南極磷蝦多肽富含18種常見氨基酸，8種必需氨基酸種類齊全，EAA/TAA和EAA/NEAA分別在40以上和64以上，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式，蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。

低溫凍藏（-80℃）的南極磷蝦在解凍過程中由于細(xì)胞內(nèi)外冰晶的機(jī)械損傷，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，存在于細(xì)胞間質(zhì)的金屬蛋白酶（如dispase）和細(xì)胞內(nèi)外的絲氨酸蛋白酶（如蛋白酶K、胰蛋白酶等）作用于肌肉組織中的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白[19]，特別是在解凍升至室溫在經(jīng)歷0～3℃的過程中南極磷蝦迅速自溶[15]，如果這個(gè)階段經(jīng)歷的時(shí)間足夠長(zhǎng)，這種自溶作用帶來的蛋白質(zhì)降解最高可以達(dá)到20%以上，在繼續(xù)添加外來的蛋白質(zhì)水解酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶并在該酶的最適pH條件下，大部分自溶作用酶被抑制，南極磷蝦肌肉組織中的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白被外源蛋白水解酶繼續(xù)水解，從正交實(shí)驗(yàn)處理的南極磷蝦多肽氨基酸構(gòu)成沒有較大差別的結(jié)果分析，加入足夠酶活力數(shù)量單位的蛋白水解酶如木瓜蛋白酶（加入樣品中的酶活力單位為120000u）、胃蛋白酶（加入樣品中的酶活力單位為12u）和胰蛋白酶（加入樣品中的酶活力單位為1000u）都能夠使樣品完全水解，具有廣泛酶作用位點(diǎn)的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶使南極磷蝦肌肉迅速水解，作用于精氨酸和賴氨酸肽鍵的胰蛋白酶水解南極磷蝦肌肉相對(duì)較慢。這些結(jié)論能被SDS-PAGE和氨基酸分析結(jié)果所證明。

本文通過南極磷蝦的自溶作用[23-24]繼以蛋白酶水解得到了分子量較小的南極磷蝦多肽，這為南極磷蝦的高效利用奠定了理論基礎(chǔ)。木瓜蛋白酶水解南極磷蝦獲得多肽量較高，但電泳條帶占泳帶百分量較低，初步推測(cè)是因?yàn)槟竟系鞍酌杆猥@得的多肽分子量低于11.1ku，在電泳的過程中，沒有被留在電泳凝膠上，這一推測(cè)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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