超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中的1 4種激素

陳君慧，路 勇，馮 楠，姜 潔，謝文東，江 英，趙俊平，魯 緋

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041；3.北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)一站，北京100075）

類(lèi)固醇激素和糖皮質(zhì)激素都屬于甾類(lèi)同化激素。由于其能夠促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，有利于蛋白質(zhì)的沉積，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用。然而，長(zhǎng)期攝入同化激素，可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，發(fā)育異常或腫瘤等疾病。上世紀(jì)80年代以來(lái)，許多國(guó)家或組織通過(guò)立法限制或禁止在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中使用同化激素[1]。用于測(cè)定食品中激素殘留的方法有高效液相色譜法（HPLC）[2-3]、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）[4-6]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[5-12]。目前，各國(guó)對(duì)激素類(lèi)藥物殘留的分析精確度和檢測(cè)要求越來(lái)越高，由于HPLC方法的靈敏度較低，選擇性和特異性差，已經(jīng)不適合用于痕量殘留分析的要求。GC-MS方法由于需要通過(guò)衍生，可達(dá)到殘留分析的要求，但衍生過(guò)程繁瑣，耗時(shí)耗力。目前，LC-MS/MS已成為檢測(cè)激素多殘留的首選方法，串聯(lián)質(zhì)譜的方法可有效提高方法靈敏度、選擇性和特異性，能夠痕量物質(zhì)分析的準(zhǔn)確性。但目前，激素多殘留檢測(cè)的文獻(xiàn)大多是性激素類(lèi)，而由于類(lèi)固醇類(lèi)激素和糖皮質(zhì)激素選用離子模式不同，對(duì)于其同時(shí)檢測(cè)的文獻(xiàn)較少，且儀器分析時(shí)間較長(zhǎng)，影響了分析效率。本研究建立了動(dòng)物肌肉組織中睪酮、群勃龍及寶丹酮等7種合成類(lèi)固醇類(lèi)激素和地塞米松、曲安奈德及曲安西龍等7種糖皮質(zhì)激素藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，可以滿(mǎn)足動(dòng)物肌肉組織中不同離子模式的激素多殘留6min快速、同時(shí)分析的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司；甲酸、乙酸銨 HPLC級(jí)，CNW technologies公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、無(wú)水硫酸鈉 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水；醇勃龍（10161-33-8，98.2%）、寶丹酮（846-48-0，98.5%）、黃體酮（57-83-0，99.0%）、睪酮（58-22-0，99.5%）、甲睪酮（58-18-4，98.0%）、19-去甲睪酮（434-22-0，99.5%）、美雄酮（72-63-09，98.0%）、可的松（53-06-5，98.5%）、地塞米松（50-02-2，97%）、甲基潑尼松（83-43-2，99.0%）、潑尼松龍（52-21-1，99.2%）、潑尼松（53-03-2，99.0%）、曲安西龍（124-94-7，98.0%）、曲安奈德（76-25-5，98.4%） 德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司；標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g激素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分別配制成1000μg/mL的溶液作為儲(chǔ)備液，-20℃以下保存3個(gè)月；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 準(zhǔn)確量取激素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用甲醇溶液稀釋成適宜質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

XEVO TQS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；分析天平 北京賽多利斯有限公司；PL602-L電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；CQ25-12D超聲波清洗器 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；EYEL4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)明儀器有限公司；3-18K冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；OASYSTM N-EVAPTM112氮吹儀 美國(guó)；超純水制備儀 美國(guó)Milipore公司；Oasis HLB固相萃取柱（6mL，150mg）、Oasis MCX固相萃取柱（6mL，150mg）、固相萃取柱裝置 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)?。?±0.05）g動(dòng)物肌肉組織于50mL聚四氟乙烯離心管中，加20mL乙酸乙酯，漩渦混合振蕩2min，超聲提取20min，10000r/min離心10min，移取乙酸乙酯層。于殘?jiān)屑尤?0mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并兩次提取液，35℃旋轉(zhuǎn)蒸至近干，加5mL 30%甲醇水溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

1.2.2 樣品的凈化 移取提取液，上樣于已活化的Oasis HLB固相萃取柱（預(yù)先用5mL甲醇與5mL水活化），待濾液全部流出小柱后，棄去濾液。再用5mL水、5mL甲醇-水（1∶1，v/v）以2～3mL/min流速淋洗萃取柱，抽干，棄去流出液。用5mL甲醇-乙腈洗脫液（1∶1，v/v）洗脫，收集置于刻度試管中，洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈?。?mL乙腈-水（1∶1，v/v）溶液溶解殘?jiān)⒍ㄈ荩?.22μm聚四氟乙烯過(guò)濾器過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（1.8μm，2.1mm×50mm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和5mmol乙酸銨0.1%甲酸水溶液（B）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 色譜分離梯度洗脫條件Table 1 UPLC gradient elution conditions

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓：3.2kV（ESI+）、2.5kV（ESI-）；錐孔電壓：50V，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：350℃，去溶劑氣流量：900L/Hr，碰撞腔真空度：700kPa，監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。14種激素質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選用串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集信號(hào)，采用正負(fù)離子切換的方式，以100μg/kg的激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液自動(dòng)調(diào)諧，在ESI+模式下，7種類(lèi)固醇類(lèi)激素可以形成[M+H]+分子離子峰，在ESI-模式下，7種糖皮質(zhì)激素可以形成 [M+HCOO]-分子離子峰，然后進(jìn)行相應(yīng)的子離子掃描，確定特征子離子，14種激素的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 液相色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇 本研究中同為甾體激素藥物的7種類(lèi)固醇激素與7種糖皮質(zhì)激素的結(jié)構(gòu)主要是由碳、氫及氧組成的中性化合物，極性較小。目前，甾體激素類(lèi)藥物常用的液相色譜柱為C18色譜柱。實(shí)驗(yàn)考查了不同型號(hào)色譜柱（BEH C18與HSS T3）及不同長(zhǎng)短色譜柱對(duì)色譜分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)表明，50mm的色譜柱可滿(mǎn)足14種激素檢測(cè)分離的要求；因HSS T3耐受的pH范圍較寬，且耐受純水相等特點(diǎn)，與BEH C18相比，可改善目標(biāo)化合物的色譜峰形，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在色譜柱有較強(qiáng)保留的效果，因此，通過(guò)以上因素的考查，選定ACQUITY HSS T3為最佳色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 考慮糖皮質(zhì)激素在電離過(guò)程中，在ESI-電離模式下需要產(chǎn)生[M＋HCOO]-分子離子峰，即選擇[M＋HCOO]-作為碰撞誘導(dǎo)解離的母離子，才可獲得較高豐度的[M＋HCOO]-分子離子峰，因此，在流動(dòng)相中加入了適量的甲酸以提供其加和離子+HCOO的需求。實(shí)驗(yàn)比較了有機(jī)溶劑乙腈或甲醇（A相）與甲酸水溶液或乙酸銨甲酸緩沖液（B相）分離激素的效果，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在甲醇-乙酸銨甲酸緩沖液流動(dòng)體系，采用梯度洗脫程序，14種激素藥物在6min內(nèi)分離效果較好，響應(yīng)較高，且峰形對(duì)稱(chēng)，不拖尾、不前延，14種激素藥物10μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM離子流色譜圖見(jiàn)圖1，圖2為空白雞肉基質(zhì)中添加濃度為5μg/kg時(shí)的各通道提取的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的定量離子流色譜圖。

表2 14種激素質(zhì)譜分析條件參數(shù)Table 2 MS parameters for the analysis of 14 hormones

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)中14種甾體同化激素較易溶解于極性溶劑中，因此，考察了甲醇、乙腈及乙酸乙酯3種不同提取溶劑對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，甲醇的提取效果較差，14種甾體同化激素的平均回收率在45.5%左右，且提取雜質(zhì)較多，不易凈化；而乙腈與乙酸乙酯相比，兩者提取效果相當(dāng)，平均回收率在70.8%以上，因乙酸乙酯較易濃縮，故選取乙酸乙酯作為提取溶液，可以滿(mǎn)足動(dòng)物肌肉組織中14種激素的提取要求。

2.3.2 固相萃取柱的選擇 因甾體同化激素的殘留量較低，而動(dòng)物肌肉組織中的干擾物較多，因此，本研究采用固相萃取柱凈化。實(shí)驗(yàn)考查了通用型較強(qiáng)的HLB柱與強(qiáng)陽(yáng)離子MCX柱的凈化效果，結(jié)果表明，HLB柱的效果較好，14種激素的平均回收率在80%以上；MCX柱對(duì)7種類(lèi)固醇類(lèi)激素的凈化效果相對(duì)較好，平均回收率在75%左右，而對(duì)7種糖皮質(zhì)激素的凈化效果較差，只有15%左右。因此，選取HLB柱作為凈化固相萃取柱。

2.3.3 固相萃取洗脫溶液的選擇 實(shí)驗(yàn)考查了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1/1，v/v）對(duì)激素藥物的洗脫能力，結(jié)果顯示，甲醇洗脫時(shí)，其平均回收率在51.8%～81.9%之間，乙腈洗脫時(shí)，其平均回收率在60.8%～82.8%之間，甲醇-乙腈（1/1，v/v）洗脫時(shí)，平均回收率在78.9%～90.5%之間。因此，可看出，甲醇-乙腈（1/1，v/v）的洗脫能力最強(qiáng)，乙腈的洗脫能力略高于甲醇，故選取甲醇-乙腈（1/1，v/v）作為洗脫溶劑。

2.3.4 樣品溶解液的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-5mmol乙酸銨0.1%甲酸水溶液（1/9，v/v）與乙腈-水（1/1，v/v）溶解溶液，甲醇-5mmol乙酸銨0.1%甲酸水溶液（1/9，v/v）溶解時(shí)，黃體酮與地塞米松的平均回收率低于40%，其余12種激素藥物的平均回收率在80%左右。而乙腈-水溶解時(shí)，可達(dá)到14種激素藥物全部溶解，且平均回收率在85%以上，因此，選用乙腈-水（1/1，v/v）作為樣品溶解液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 空白雞肉試樣按照前處理方法進(jìn)行樣品前處理，并加入不同濃度的14種激素標(biāo)樣混合溶液（0.5、1、2、5、8、10、20、50μg/kg），處理后進(jìn)樣，以待測(cè)物色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，本方法在0.5～50μg/kg范圍呈良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，以3倍信噪比計(jì)算其方法檢出限（LOD）在0.3～1.0μg/kg之間。

圖1 14種激素的MRM離子流圖（10μg/kg）Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of 14 hormones（10μg/kg）

圖2 空白基質(zhì)中添加5.0μg/kg激素藥物的MRM離子流圖Fig.2 MRM chromatograms of a blank animal fortified with 14 hormones at 5.0μg/kg for each

2.4.2 方法回收率與精密度 在空白雞肉試樣中添加低、中、高（2、5、10μg/kg）3個(gè)不同濃度水平的14種激素藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理，測(cè)定目標(biāo)化合物，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并考察實(shí)驗(yàn)方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，14種激素藥物的平均回收率為72.48%～114.52%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.93%～11.17%。

表3 14種激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Regression equations,limits of determination and limits of quantification of 14 hormones

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中的類(lèi)固醇類(lèi)激素和糖皮質(zhì)激素殘留的分析方法。試樣前處理方法靈敏度高，精密度好，特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，回收率高且穩(wěn)定；同時(shí)，利用電噴霧正負(fù)離子同時(shí)掃描檢測(cè)的技術(shù)，可以滿(mǎn)足動(dòng)物肌肉組織中不同離子模式的激素多殘留分析同時(shí)檢測(cè)要求。

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表4 不同添加水平回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Results of recovery and precision tests（n=6）

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