E R I C-P C R技術(shù)對單增李斯特菌的溯源分析

劉海泉，朱 穎，姜文潔，孫曉紅，吳啟華，潘迎捷，趙 勇，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；4.美國緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系，美國緬因州04469-5735）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種重要的食源性致病菌[1]，因感染后引起的李氏桿菌病死亡率約為20%～30%[2]。根據(jù)李斯特菌具有特定的表面蛋白，結(jié)合玻片凝集實(shí)驗(yàn)，單增李斯特菌至少有13種血清型[3]。目前，單增李斯特菌流行病學(xué)調(diào)查的傳統(tǒng)方法多以血清分型、噬菌體分型等表型分析方法為主[4-6]，這些傳統(tǒng)的分型方法常常存在較高的誤差。分子分型是一種新興的流行病學(xué)調(diào)查手段，不僅克服了血清分型等傳統(tǒng)方法的不足，還能從遺傳學(xué)角度進(jìn)行流行規(guī)律探討。其中，ERIC-PCR是基于“腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列”（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）具有分型率較高、準(zhǔn)確性好、簡便快捷、無需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，首先在大腸桿菌中應(yīng)用[7]；隨后擴(kuò)展到其他人類病源菌，包括沙門氏菌[8-9]、副溶血性弧菌[10-12]等，以及動物及植物病原菌[13-15]。本研究采用ERIC-PCR法對從三個(gè)農(nóng)貿(mào)市場豬肉樣品分離到的17株菌株進(jìn)行了基因分型，并進(jìn)行了多樣性分析，探討了基因型與區(qū)域性分布的關(guān)聯(lián)性，以期為單增李斯特菌的溯源和流行性分析提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[16]從上海地區(qū)三個(gè)農(nóng)貿(mào)市場的豬肉樣品中分離到17株單增李斯特菌菌株（表1），這些菌株分別從市場中不同攤位的樣品中分離出；單增李斯特菌ATCC 19115（簡寫為LM） 作為陽性對照；Taq DNA聚合酶、dNTP 大連TaKaRa公司；Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 杭州Bioer公司；DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K 北京天根生化科技有限公司；李斯特菌選擇性增菌液（LB1）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA） 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；李斯特菌選擇性瓊脂（PALCAM）、腦心浸液（BHI）、抗生素 英國OXOID公司；Milli-Q水。

表1 菌株來源及背景Table 1 Source and background of the strains

離心機(jī)、PCR儀、微量移液器 德國Eppendorf；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌DNA提取 取于-80℃、25%甘油保存的菌種，接種于BHI肉湯在37℃下復(fù)蘇后，劃線接種于TSA瓊脂，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，在37℃下培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=0.8）。再劃線接種于PALCAM瓊脂上于37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)活化2次。挑取單菌落，接種于LB1中，37℃ 170r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600=0.8提取DNA[17]。使用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。按照說明書提取DNA。

1.2.2 PCR方法 ERIC-PCR引物參照J(rèn)ersek等[18]的設(shè)計(jì)。正向引物Eric1R：ATGTAAGCTCCTGGGGATT CAC，反向引物Eric2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAG CG，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系溶液體積為25μL，其中ddH2O 16.2μL、10×緩沖液（+Mg2+）2.5μL、dNTPs（2.5mmol·L-1）2.0μL、引物10μmol·L-1各1μL、Taq酶（5U·μL-1）0.3μL、模板DNA 2.0μL。

PCR程序如下：95℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，92℃30s，50℃ 30s，52℃ 1min，65℃8min，共循環(huán)35次；最后65℃維持8min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠120V電壓，電泳30min。

1.2.3 ERIC-PCR分型結(jié)果分析 經(jīng)BioRad Molecular Imager? Gel Doc TM XR凝膠拍照后，使用自帶的ImageLab Version 3.0分析軟件中的“分析工具箱”-“泳帶和條帶”進(jìn)行泳帶分析；采用“1”和“0”的方式記錄在Excel中，每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶存在時(shí)賦值為“1”，不存在時(shí)賦值為“0”。最后，通過NTsys 2.10e進(jìn)行分析，得到Jaccard的遺傳相似性系數(shù)矩陣和遺傳距離矩陣，采用非加權(quán)配對法（UPGMA法）做遺傳分析的樹狀圖。凡相似度大于0.8者為同一亞型，小于0.8者為不同的基因型[19]

2 結(jié)果與討論

2.1 單增李斯特菌的ERIC-PCR分型

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，17株單增李斯特菌和質(zhì)控菌株ATCC 19115（LM）經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生了12種不同的指紋圖，且指紋圖譜呈現(xiàn)出多態(tài)性（圖1）。PCR產(chǎn)物為3～8條，主帶為2條。

圖1 單增李斯特菌菌株ERIC-PCR指紋圖Fig.1 ERIC-PCR fingerprints of Listeria monocytogenes strains注：1.ATCC 19115；2～18，LM1～LM17。

2.2 單增李斯特菌ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析

聚類分析結(jié)果表明，17株單增李斯特菌分為了至少6個(gè)基因類群，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ型（圖2）。其中Ⅳ型菌株最多，達(dá)11株；Ⅴ型略少，為2株；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ型最少，均只有1株，其中LM1與質(zhì)控菌株ATCC 19115最近。

從圖2可以看出，菌株LM2、LM10、LM12和LM13，LM5和LM8，LM6和LM7可能為同一菌株。大部分菌株可能為LM9菌株的相似菌株，而菌株LM1與菌株LM16和LM17位于另外的分枝。菌株LM2、LM3、LM4、LM5、LM6、LM7、LM8、LM10、LM11、LM12和LM13為同一分支，說明它們可能為同類菌株，但來源不同，說明該類菌污染了多個(gè)不同樣品，是重要的污染食品的菌株類型；菌株LM12/LM13、LM14/LM15、LM16與LM17為同一批次、同一采集點(diǎn)、不同樣品分離到的，它們處于不同分支，說明它們不是同一菌株，這揭示在同一地點(diǎn)有可能污染多種單增李斯特菌。菌株LM1、菌株LM9、菌株LM14/LM15、LM16和LM17分別代表了不同菌株，而它們分別只在一個(gè)地點(diǎn)分離得到，說明它們是在本實(shí)驗(yàn)采樣范圍內(nèi)，污染食品較少的一株單增菌株。這17株菌株中至少包含了6種血清型。

圖2 17株單增李斯特菌指紋圖譜聚類分析圖Fig.2 Dendrogram based on UPGMA cluster analysis of ERIC-PCR data from 17 Listeria monocytogenes strains

此外，從不同地點(diǎn)分離到的單增李斯特菌呈現(xiàn)出不同的聚類特征。其中，市場3中分離出的菌株表現(xiàn)為最多的基因型類群，而市場1和2中分離到的基因型類群主要是Ⅰ和Ⅳ類群；Ⅳ類群是主要類群（圖3）。

通過分析可以發(fā)現(xiàn)ERIC-PCR基于基因組上的特定重復(fù)序列能夠很好把來源不同的單增李斯特菌菌株進(jìn)行區(qū)分、歸類，進(jìn)而達(dá)到溯源目的。

圖3 單增李斯特菌ERIC-PCR基因型類群與分離點(diǎn)間的關(guān)系Fig.3 Relationship between Listeria monocytogenes strains’sources and ERIC-PCR genotypes

單增李斯特菌是一種食源性、細(xì)胞內(nèi)寄生致病菌，可引起嚴(yán)重的李氏桿菌病，已引起了公眾和食品安全專家的關(guān)注。由于其天然抗性，單增李斯特菌在自然界和食品加工廠中廣泛存在，99%的人類李氏桿菌病是因食用受污染的食品而引起[2，20]的。雖然單增李斯特菌不形成芽孢，它可以在食品加工環(huán)境中廣泛存在，并能堅(jiān)持較長的時(shí)間，甚至數(shù)年之久[21]。單增李斯特菌已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。由于單增李斯特菌菌株的毒力和致病性存在差異，具有多樣性[22]。而亞型分型可以準(zhǔn)確、迅速地確定或追蹤單增李斯特菌單個(gè)菌株，這在控制和預(yù)防李氏桿菌病以及菌株的流行病學(xué)和群體遺傳學(xué)研究是必不可少的，這樣可以阻止李氏桿菌病的蔓延和減少不必要的食品召回。分子示蹤能夠準(zhǔn)確地評價(jià)單增李斯特菌特定的污染來源[23]。

基因分型的方法包括了基于基因片段的亞型技術(shù)[脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified-fragment length polymorphism，AFLP）、核糖體分型、質(zhì)粒分型（plasmid typing）、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)分析（multilocus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA）和可變位點(diǎn)或缺檢測（detection of loci that are variably absent or present，VAP）]；基于PCR的分型技術(shù)[隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP），PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）和重復(fù)元素PCR（repetitive element PCR，REP-PCR技術(shù)）]和DNA測序?yàn)榛A(chǔ)的亞型技術(shù)[多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）、多毒力位點(diǎn)序列分型（multiple-virulence-locus sequence typing，MVLST）和單位點(diǎn)的測序和單核苷酸多態(tài)性（SNP）][24-25]。雖然PFGE法準(zhǔn)確性最高，但由于操作步驟繁雜，且需要特殊儀器，在普通實(shí)驗(yàn)室很難開展；而ERIC-PCR法操作簡便，無需特殊儀器，且重復(fù)性和區(qū)分能力同PFGE非常相近，更易于在普通實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用[26]。雖然根據(jù)Hunter等[27]介紹的計(jì)算方法，該分型方法的辨別指數(shù)值只有60%，但通過金莉莉等[28-30]從2002年使用ERICPCR來鑒定食品中的單增李斯特菌，以及本研究進(jìn)一步表明ERIC-PCR能夠很好的區(qū)分不同來源單增李斯特菌菌株來看，ERIC-PCR為單增李斯特菌的流行病學(xué)調(diào)查以及有效防控單增李斯特菌的污染，提供了適用于普通實(shí)驗(yàn)室的簡單、方便、快捷、準(zhǔn)確的方法。

3 結(jié)論

ERIC-PCR技術(shù)能夠區(qū)分、鑒別不同來源的單增李斯特菌菌株，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室對食品中單增李斯特菌溯源及示蹤，為控制食品中單增李斯特菌的污染及防控李氏桿菌病提供了切實(shí)可行的工具。

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