液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留

郭啟雷，史海良，楊紅梅，王 浩，劉艷琴

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

動(dòng)物源性食品中抗生素的殘留一直是威脅食品安全的重大隱患之一。雖然國家已經(jīng)頒布了相關(guān)管理?xiàng)l例，但是由于各種原因，我國動(dòng)物源性食品中抗生素殘留問題依然存在。萬古霉素（Vancomycin）和去甲萬古霉素（Norvancomycin）屬于糖肽類抗生素[1-2]，分子中含有糖及肽鏈結(jié)構(gòu)，在臨床常用于由革蘭陽性菌尤其是葡萄球菌、腸球菌和肺炎鏈球菌所致嚴(yán)重感染性疾病的治療。由于與其他抗生素截然不同的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)于常見抗生素的耐藥菌株來說，萬古霉素通常是其唯一有效的治療藥物，代表著治療這些嚴(yán)重感染性疾病的最后防線。傳統(tǒng)上，萬古霉素被用作“最后一線藥物”，用來治療其他抗生素?zé)o效的嚴(yán)重感染。萬古霉素的濫用，會(huì)造成超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)和個(gè)體對(duì)常規(guī)抗生素的耐受，給臨床抗感染治療帶來極大困難，可能面臨無藥可用的困境。另外，萬古霉素本身具有一定的耳毒性和腎毒性。目前，對(duì)萬古霉素的含量測(cè)定研究多集中在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，研究對(duì)象涉及血清、血漿、尿液及藥物制劑[2-7]。動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，本文選擇牛奶為研究對(duì)象，優(yōu)化適宜的提取、凈化和富集方法，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用其強(qiáng)大的定性能力，排除基質(zhì)干擾，準(zhǔn)確定性，同時(shí)利用其高靈敏度特性對(duì)牛奶中的萬古霉素、去甲萬古霉素的殘留量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、甲酸 美國Fisher公司，色譜純；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、氨水、三氯乙酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；Oasis MCX（60mg，3 mL）固相萃取小柱 美國waters公司；萬古霉素、去甲萬古霉素 中國藥品生物制品檢定所。

Agilent 1200高效液相色譜儀 Agilent 6410A三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，ESI），美國Agilent公司；Milli Q超純水發(fā)生器 美國密理博公司；電子天平，感量0.0001、0.01g 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-88B旋渦混合器 其林貝爾儀器制造有限公司；KQ5200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18柱，150mm×2.1mm（id），3.5μm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1；流速：0.2 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Elution gradient of HPLC

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI源）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10L/min；霧化器壓力；40psi；毛細(xì)管電壓：4000V。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量見表2。

表2 萬古霉素和去甲萬古霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of vancomycin and norvancomycin

1.2.3 樣品處理 稱取牛奶樣品5.0g（精確至0.01g）于25mL比色管中，加入5mmol/L EDTA-1%三氟乙酸水溶液定容至25mL，渦旋混勻，超聲提取15min，過濾后取10mL濾液轉(zhuǎn)移至Oasis MCX固相萃取柱（預(yù)先用甲醇和1%三氟乙酸水溶液各5mL活化、平衡），先后用5mL水、甲醇淋洗，棄去淋洗液。用5mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液并于緩慢氮?dú)饬飨聦⒂袡C(jī)相吹干。樣品用50%甲醇水溶液復(fù)溶并定容到1.0mL，混勻，過0.22μm有機(jī)相濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

萬古霉素是多肽類抗生素，分子量為1448，進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，與兩個(gè)H+結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的雙電荷離子，因此選擇豐度最大的[M+2H]2+m/z 725.3作為萬古霉素的母離子。產(chǎn)生碎片離子主要有m/z 99.9、m/z 143.9、m/z 1306.4（見圖1（a）），選擇豐度最大的m/z 99.9為定量離子，m/z 143.8為定性離子。類似的，去甲萬古霉素的分子量為1433，選擇雙電荷離子m/z 718.0作為去甲萬古霉素的母離子。產(chǎn)生碎片離子主要有m/z 99.9，m/z 144.0、m/z 1292.0（見圖1（b）），選擇豐度最大的m/z 144.0為定量離子，m/z 99.9為定性離子。

2.2 液相條件的選擇

圖1 二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Product ion spectra

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram

多肽類抗生素本身帶有的氨基、羧基和酚羥基，實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈、5mmol/L乙酸銨-乙腈對(duì)離子化的影響。結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液-乙腈體系能使多肽類在質(zhì)譜中有最好的響應(yīng)值，這是由于甲酸可以為陽離子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率，因此選用甲酸作為酸度調(diào)節(jié)劑。由于牛奶樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，采用梯度洗脫程序，待萬古霉素和去甲萬古霉素出峰后采用大比例有機(jī)相沖洗色譜柱，提高色譜柱的耐受性和方法的重現(xiàn)性，在優(yōu)化后的分析條件下，萬古霉素和去甲萬古霉素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖見圖2。

表3 牛奶中萬古霉素、去甲萬古霉素的線性范圍、線性方程、檢出限及回收率Table 3 Linear ranges，regression equations，LOD，recovery and repeatability for 2 polypeptides in milk

2.3 線性范圍、回收率和精密度

用空白樣品提取液制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，萬古霉素和去甲萬古霉素的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表3。以信噪比為3估算檢出限（LOD），2種多肽抗生素的檢出限見表3。通過相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比值計(jì)算，萬古霉素和去甲萬古霉素的基質(zhì)效應(yīng)為分別為92.5%和99.1%，顯示本方法前處理的良好效果。

采用經(jīng)測(cè)定不含有萬古霉素、去甲萬古霉素的牛奶樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品添加20、50、100μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)樣測(cè)定。平均添加回收率（每個(gè)添加濃度平行測(cè)定5次）為72.5%～87.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，結(jié)果見表3。采用本方法對(duì)市場(chǎng)上的20例牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論

本文以牛奶為研究對(duì)象，采用三氯乙酸沉淀蛋白，混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性定量分析，建立了牛奶中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留的檢測(cè)方法，方法加標(biāo)回收率為72.5%～87.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。該方法操作簡(jiǎn)單，具有較高的靈敏度和選擇性，滿足對(duì)牛奶中多肽類抗生素的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。

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