18β-甘草次酸對W istar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠腦微動脈平滑肌細胞縫隙連接的影響*

陳新燕，司軍強，李 麗，趙 磊，魏麗麗，蔣學偉，馬克濤

（石河子大學醫(yī)學院地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，生理學教研室，新疆石河子832002）

縫隙連接是相鄰細胞間直接進行信息、能量和物質(zhì)交換的通道，參與細胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖等生理過程起著重要的調(diào)控作用?？p隙連接是由連接相鄰兩個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)?？p隙連接的基本單位稱連接子，每個連接子由6個相同或不同的連接蛋白亞單位環(huán)繞，中心形成約1.5 nm的孔道，相鄰細胞膜上的兩個連接子對接便形成2～3 nm的縫隙連接。高血壓是全球最常見的慢性病，各類高血壓都源于血管緊張度的改變?？p隙連接在血管平滑肌舒縮運動中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，它是電化學信號在細胞間傳遞的直接通路，使得相鄰平滑肌細胞內(nèi)的鈣離子實現(xiàn)同步化改變。研究發(fā)現(xiàn)連接蛋白和高血壓有著密切的聯(lián)系。例如，特異性敲除血管內(nèi)皮細胞連接蛋白43和連接蛋白40基因后，小鼠出現(xiàn)高血壓和心肌肥厚［1］。連接蛋白40基因多態(tài)性是高血壓的危險因素［2］。此外，Saltman等報道應用縫隙連接阻斷劑庚醇通過阻斷心肌細胞間的縫隙連接通訊，能夠顯著的減少梗死面積［3，4］。因此，縫隙連接阻斷劑將會是治療心腦血管疾病非常重要的工具。18β-GA是強效的非選擇性的縫隙連接阻斷劑，是目前生物學研究中較常用的縫隙連接阻斷劑。本實驗在急性分離正常血壓Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）腦微動脈標本上應用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察18βGA對血管腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及標本制備

選擇36周齡雄性SHR及正常血壓Wistar大鼠，分別購自北京維通利華實驗動物有限責任公司和新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。SHR為實驗組，Wistar大鼠為對照組，每組各10只。大鼠在麻醉狀況下放血處死，迅速取出大腦，置于生理鹽溶液中，溶液成分（mmol／L）如下：NaCl 138.0，KCl 5.0，CaCl21.6，MgCl21.2，Na-HEPES 5.0，HEPES 6.0，葡萄糖 7.5。在生理鹽溶液中，迅速取出腦動脈及其分支。

腦微動脈段標本制備：將截取好的腦動脈（brain artery，BA）標本置于培養(yǎng)皿中，動脈兩端用細鉑金片固定在培養(yǎng)皿底部，放入含有膠原酶A（1.5mg／ml）的生理鹽溶液在37℃溫箱中處理15 min，生理鹽溶液置換兩次去除殘存膠原酶A，顯微鏡下進一步去除結(jié)締組織。將處理好的腦動脈轉(zhuǎn)移至倒置顯微鏡下進行全細胞膜片鉗實驗。

單個平滑肌細胞制備：將腦微動脈及其分支置于細胞分離液中 20 min，分離液成分為（mmol／L）：NaCl 142，KCl 5，CaCl20.05，MgCl21，Na-HEPES 4，HEPES 5，葡萄糖7.5。移去細胞分離液將腦微動脈剪成幾段放入消化液并在37℃溫箱中消化20～25 min，消化液成分包括（mg／ml）：膠原酶 IA 1，木瓜蛋白酶 0.75，牛血清白蛋白 3.75，二硫蘇糖醇 0.3。1 000 r／min離心6min后棄上清液，加入細胞分離液制成細胞懸浮液，反復替換三次后，將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置30 min使細胞貼壁后進行全細胞膜片鉗實驗。

1.2 全細胞膜片鉗記錄

在室溫條件下（22～25℃）標本持續(xù)灌注生理鹽溶液（0.2ml／min）進行全細胞膜片鉗實驗。記錄電極阻抗約為5 MΩ，由P-97拉制儀拉制。電極內(nèi)液成分是（mmol／L）：K-gluconate 130，NaCl 10，CaCl22.0，MgCl21.2，HEPES 10，EGTA 5，葡萄糖 7.5。通過微操縱器接觸到細胞后給予負壓形成GΩ封接。補償電極電容后給予瞬時較強負壓或者電刺激擊破細胞膜形成全細胞膜片鉗，膜電流用10 kHz（-3 dB）低頻濾過［5］。通過PC計算機記錄生物電信號。形成全細胞記錄模式后，鉗制電壓為-40 mV，-140 mV至＋60mV為電壓刺激區(qū)間，實驗中選取此電壓區(qū)間的I／V曲線率作為記錄細胞靜息狀態(tài)下的 Ginput和Rinput，平滑肌細胞的Cinput則通過公式C＝Q／V獲得。由電極電阻（Ra）引起的實際鉗制電壓（Vm）與命令電壓（Vc）誤差通過公式Vm＝Vc-I×Ra進行離線補償。

1.3 試劑

所用藥物用生理鹽溶液配制，通過開關(guān)控制藥物灌流標本，保持灌流速度、溫度和其它成分不變。用生理鹽溶液配制不同濃度的18β-GA，濃度一次為（μmol／L）：0.001，0.01，0.1，1，10，100。18β-GA由Sigma公司提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 統(tǒng)計學分析

結(jié)果以均數(shù) ±標準差（±s）表示，應用 SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 SHR和W istar大鼠尾動脈血壓

SHR的收縮壓為（187.7±9.6）mmHg，明顯高于正常 Wistar大鼠的收縮壓（121.2±10.6）mmHg（P＜0.01）。

2.2 SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接耦聯(lián)力增強

SHR和Wistar大鼠腦動脈平滑肌細胞膜電容分別是（95±18）pF和（178±54）pF，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞膜電導分別是（3.42±1.17）nS和（7.90±0.89）nS，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞膜電阻分別是（331±79）MΩ和（139±17）MΩ，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1）。

2.3 18β-GA抑制W istar大鼠和 SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接

表1總結(jié)了18β-GA對Wistar大鼠和SHR腦微動脈段上平滑肌細胞 Rinput、Ginput和 Cinput的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應用 100μmol／L 18β-GA后細胞的 Rinput、Ginput和Cinput與單個平滑肌細胞數(shù)值十分接近。此外，對正常Wistar大鼠和SHR細胞膜電容充放電用單指數(shù)方程分別進行擬合（圖1A和B中虛線部分），應用18β-GA前擬合效果較差（r＞0.90），應用 100 μmol／L 18β-GA后擬合效果很好（r＞0.98），且細胞Cinput的充放電的時間也顯著降低。

Tab.1 Influence of18β-GA on themembrane properties of smoothmuscle cells in the cerebral arteriolar segments（n＝12）

Fig.1 18β-GA inhibits the gap junctionsbetween the smoothmuscle cells ofWistar rat and SHR

應用斜坡電壓刺激發(fā)現(xiàn)，18β-GA凈電流 I／V曲線幾乎是線性（圖2），且18β-GA凈電流翻轉(zhuǎn)電位點與腦微動脈段上平滑肌細胞靜息膜電位十分接近。提示18β-GA主要抑制細胞間的縫隙連接，減少細胞的Ginput。

Fig.2 The 18β-GA induces net current I-V curves

18β-GA對Wistar大鼠和SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接的抑制具有濃度依賴性（圖3），0.001～100μmol／L的 18β-GA可以濃度依賴的抑制BA腦微動脈段上平滑肌細胞Ginput。18β-GA抑制Wistar大鼠和SHR腦微動脈段上平滑肌細胞Ginput的 IC50分別為 1.7和 2.0μmol／L，兩種腦微動脈間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)SHR腦微動脈段上平滑肌細胞Cinput和Ginput高于Wistar大鼠，提示SHR腦動脈平滑肌細胞間縫隙連接耦聯(lián)力增加，其可能的意義是SHR通過提高細胞間的電化學信息傳遞，保持血管舒縮的同步性。眾所周知，血管緊張度的增加是心腦血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵，而以細胞間的縫隙連接為途徑進行細胞間直接信息交流的異常改變與血管緊張度密切相關(guān)［6］。血管腦微動脈上縫隙連接通道存在于平滑肌細胞間、內(nèi)皮細胞間以及平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞間［7-9］。通過縫隙連接通道傳遞電信號和化學物質(zhì)交流，這就使得血管腦微動脈能夠在縱向上和橫向上保持電活動、機械活動的同步性，使整個血管成為統(tǒng)一的功能單位，對興奮性或非興奮性物質(zhì)作出統(tǒng)一的反應，維持了血管功能的穩(wěn)定和一致。而在病理情況下，異常細胞的傷害性信息也可通過縫隙連接傳遞至正常細胞引起病理性改變。

Fig.3 Concentration-dependent inhibition by 18β-GA of themembrane input conductance（Ginput）of the smoothmuscle cells of Wistar ratand SHR

本實驗還發(fā)現(xiàn)在急性分離的Wistar大鼠和SHR腦微動脈上18β-GA可以濃度依賴的抑制平滑肌細胞間縫隙連接。此結(jié)果通過以下三個方面得以證實：（1）18β-GA可使腦微動脈段上平滑肌細胞Rinput增加或者Ginput減少至單個細胞水平。（2）應用18β-GA后腦微動脈段上平滑肌細胞Cinput值與單個平滑肌細胞的Cinput值相似。（3）應用18β-GA前，腦微動脈段上記錄平滑肌細胞膜充放電時間遠高于單個平滑肌細胞，且單指數(shù)方程擬合的效果很差。應用18β-GA后，細胞膜充放電時間降低到單個細胞水平，且單指數(shù)方程可以很好的擬合［10］。以上結(jié)果提示當 18β-GA濃度≥100μmol／L時可以完全阻斷Wistar大鼠和SHR腦微動脈平滑肌細胞間的縫隙連接。此外，18β-GA對Wistar大鼠和SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接的抑制效力相似。

總之，本研究中我們應用膜片鉗技術(shù)從縫隙連接阻斷劑18β-GA對Wistar大鼠和SHR縫隙連接的影響做了初步研究，提示自發(fā)性高血壓腦動脈平滑肌細胞間的縫隙連接的表達或功能增強，促使縫隙連接耦聯(lián)力增強，保持了血管舒縮的同步性。這對了解細胞間的相互調(diào)節(jié)機制，以及在病理條件下的變化具有重要的意義，并可能成為干預病變的新靶點，也為臨床治療心腦血管疾病開辟了新的依據(jù)和思路。隨著今后在血管性疾病中功能和各種調(diào)節(jié)機制認識的不斷提高，必將為治療心腦血管疾病提供更多有價值的臨床信息。

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