低溫低氧復合應(yīng)激對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的損傷作用研究*

張競丹，楊丹鳳，曹燕卿，李 曦，安玉林，劉嘉瀛，汪 海

（1.中南大學公共衛(wèi)生學院，湖南長沙410078；2.軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津300050）

高原肺水腫（high altitude pulmonary edema，HAPE）是高原病中最具有代表性的一型，比較常見且發(fā)病急驟，病死率較高。關(guān)于誘發(fā)高原肺水腫的機制尚不完全清楚，較為肯定的有血液動力學改變、體液潴留和循環(huán)障礙等［1］。一般認為機體缺氧引起肺小動脈收縮而產(chǎn)生的肺動脈高壓和血管內(nèi)皮細胞損傷是高原肺水腫發(fā)生的基本原因［2］。而寒冷對高原肺水腫發(fā)生的影響的研究甚少。本文采用2×2析因設(shè)計［3］，通過觀察低溫和低氧對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）在細胞膜通透性和血管活性物質(zhì)變化方面的影響，以及二者之間的協(xié)同作用，以探討低溫和低氧兩個因素在高原肺水腫發(fā)生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、I型膠原酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國 Hyclone公司）；內(nèi)皮細胞生長添加劑 ECGS（Upstate公司）；肝素（Amresco公司）；中性蛋白酶、DMSO、MTT、明膠（美國SIGMA公司）；內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒（武漢原生代生物醫(yī)藥科技有限公司）；TRIZOL、PCR引物（美國 Invitrogen公司）；PCR相關(guān)試劑（天根生化科技有限公司）；LDH、SOD、MDA、NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

主要儀器設(shè)備：三氣培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司），顯微攝像系統(tǒng)（成都儀器廠），電子天平、酶標儀（瑞士 Tecan公司），PCR儀（美國 Biorad公司）。

1.2 PMVECs的培養(yǎng)、傳代及鑒定

參照相關(guān)文獻［4］，選用體重 100～130 g的健康雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼法處死后，迅速打開胸腔，左心耳剪一小口，從右心室注入 15～25 ml DMEM培養(yǎng)基，至肺臟發(fā)白，然后將肺取出，0.25%胰蛋白酶37℃消化5min后，pH為7.0的PBS溶液沖洗2遍，剪取2～3mm的邊緣肺組織并剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，加入2 ml I型膠原酶（2.5 mg／ml）37℃消化 15 min。然后用滴管吸出膠原酶，加入 2 ml中性蛋白酶（10 mg／ml）37℃消化 15 min。待組織塊消化完全后加入5 ml培養(yǎng)基終止消化，2 000 r／min離心 10 min，棄上清。用 3 ml胎牛血清重懸沉淀并吹打使內(nèi)皮細胞聚集，1 000 r／min離心5min，取沉淀細胞加入含有20%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3 d后換液，以后隔天換液，待細胞生長至單層即可傳代。

棄去細胞培養(yǎng)液，pH為7.0的 PBS溶液洗2遍，加入0.25%胰酶1 ml，顯微鏡下觀察，待細胞間隙逐漸增大，細胞變圓鈍后立即加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中止消化，用吸管將細胞輕輕吹落并充分混勻，細胞懸液移入離心管中，1 000 r／min離心10min。棄上清，以1∶2分裝接種進行傳代。

采用FITC標記的CD31綠色熒光及植物凝集素結(jié)合實驗進行鑒定。

1.3 實驗分組

選取2～7代生長良好的PMVECs用于實驗，用無血清培養(yǎng)基進行細胞同步化2 h，根據(jù)2×2析因設(shè)計進行實驗，按低溫和低氧兩因素的有無，分為四組：正常對照組（37℃、21%O2）、低溫組（28℃、21%O2）、低氧組（37℃、3%O2）、低溫低氧組（28℃、3%O2）。所有實驗組分別在不同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 培養(yǎng)液中LDH活力的測定

取2～7代生長良好的PMVECs以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組設(shè)3個復孔。不同條件下分別培養(yǎng)24 h后，收集各孔細胞培養(yǎng)上清液，按照LDH檢測試劑盒說明書立即檢測。

1.5 硝酸還原酶法檢測NO

取2～7代生長良好的PMVECs以2×105cells／well接種至24孔板，每組設(shè)6個復孔，80%融合后，換無血清培養(yǎng)基，四個條件下培養(yǎng)24 h。收集各孔細胞培養(yǎng)上清液，用NO試劑盒（硝酸還原酶法）檢測 NO2-／NO3-的水平。

1.6 RT-PCR法檢測VEGF、ET-1mRNA表達水平

取2～7代生長良好的PMVECs以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組六孔。每2個孔提取一個mRNA樣本。總RNA的提取嚴格按Trizol試劑說明書操作，紫外分光光度計測定其純度并定量。采用降落 PCR法：（1）94℃ 5min；（2）94℃ 30 s，61℃ 40 s，每次下降0.2℃直至55℃，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)；（3）72℃ 10min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖（TAE緩沖液）凝膠中進行電泳。用凝膠成像系統(tǒng)檢驗各條帶的積分吸光度值，以VEGF、ET-1與β-actin灰度的比值作為RT-PCR的半定量結(jié)果。引物設(shè)計如下：VEGF上游引物 5’-CAGGGAAGACAATGGGATGA-3’，下游引物 5’-AGGAAGTGGGGTAGGGAGAG-3’，擴增基因片段長度為 470 bp；ET-1上游引物5’-CTGCCACCTGGACATCATCT-3’，下 游 引 物 5’-GCTCGGAGTTCTTTGTCTGC-3’，擴增基因片段長度為198 bp；β-actin上游引物 5’-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3’，下游引物5’-AAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴增基因片段長度為430 bp。以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差（±s）表示，利用SPSS 20.0軟件進行分析和處理，對測得的數(shù)據(jù)進行完全隨機設(shè)計的方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PMVECs形態(tài)學觀察及鑒定

培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液時可見內(nèi)皮細胞團塊聚集貼壁（圖1-A），3 d后內(nèi)皮細胞團塊已經(jīng)擴增成內(nèi)皮細胞島（圖1-B）。生長至5～7 d時細胞可基本融合成片，鋪滿培養(yǎng)皿底。細胞在倒置顯微鏡下，呈典型的內(nèi)皮細胞形態(tài)，以多角形和短梭形為主，鋪路石樣鑲嵌狀排列生長（圖1-C）。第3代細胞進行FITC標記的CD31免疫熒光鑒定（圖1-D），綠色熒光即為內(nèi)皮細胞，顯示純度幾乎為100%；植物凝集素（BSI）結(jié)合實驗（圖1-E），呈明亮的綠色熒光，表示所培養(yǎng)的細胞確實為PMVECs（圖1見彩圖頁Ⅰ）。

Fig. 1 Rat pulmonary microvascular endothelial cell cultures

2.2 不同因素對PMVECs的LDH活性的影響

低溫組、低溫低氧組（Complex）的LDH活性與對照組相比均上升，且在統(tǒng)計學上具有顯著差異（P＜0.01）；與低溫組、低氧組相比，低溫低氧組的 LDH活性升高的更明顯，且具有顯著地統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。析因方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧對PMVECs細胞的 LDH活性都有影響（P＜0.01），而且兩者之間存在協(xié)同作用（P＜0.01，表1）。

2.3 不同因素對PMVECs的NO釋放量的影響

低溫組、低氧組、低溫低氧組的NO釋放量與對照組相比均有所下降，且在統(tǒng)計學上具有顯著差異（P＜0.01）。析因方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧對PMVECs細胞的NO的釋放量都有影響（P＜0.01），而且兩因素之間存在協(xié)同作用（P＜0.05，表1）。

Tab.1 LDH leakage and releasing of NO2-／NO3-from PMVECs under the four conditions（±s，n＝3）

Tab.1 LDH leakage and releasing of NO2-／NO3-from PMVECs under the four conditions（±s，n＝3）

LDH：Lactate dehydrogenase；PMVEC：Pulmonary microvascular endothelial cell**P＜0.01 vs control group； ＃＃P＜0.01 vs hypothermia group；△△P＜0.01 vs hypoxia group

Group LDH viability（U／ml） Releasing of NO2-／NO3-（μmol／L ）Control 12.49±2.24 1.237±0.035 Hypothermia 26.42±0.78** 0.653±0.020**Hypoxia 14.10±2.87 0.654±0.040**Complex 48.37±4.42**＃?！鳌?0.292±0.040**＃＃△△

2.4 不同因素對 PMVECs的 VEGF、ET-1 mRNA表達的影響

2.4.1 不同因素對PMVECs的VEGFmRNA表達的影響 可見低溫組、低氧組、低溫低氧組的VEGF mRNA表達與對照組相比上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。低溫組與低溫低氧組之間亦有著差異，并有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4.2 不同因素對 PMVECs的 ET-1 mRNA表達的影響 可見低溫組、低氧組、低溫低氧組的 ET-1 mRNA表達與對照組相比上調(diào)，低溫低氧組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而低溫組和低氧組與對照組之間沒有顯著的統(tǒng)計學差異。方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧都會使PMVECs細胞的ET-1mRNA表達上調(diào)（P＜0.01），而且低溫和低氧之間具有協(xié)同作用（P＜0.01，圖 3）。

Fig.2 Effectsof hypothermia，hypoxia and hypothermia combined with hypoxia on expression of VEGFmRNA in PMVECs（±s，n＝3）

Fig.3 Effectsof hypothermia，hypoxia and hypothermia combined with hypoxia on expression of ET-1 mRNA in PMVECs（±s，n＝3）

3 討論

隨著西部大開發(fā)和旅游業(yè)的發(fā)展，進入高原地區(qū)人員也越來越多，而高原地區(qū)的低溫低氧的惡劣環(huán)境對人體的健康構(gòu)成了很大的威脅，因此各種高原病也越來越受到重視。在高原病中高原肺水腫是比較具有代表性的一型，高原肺水腫是從低海拔地區(qū)快速進入高海拔地區(qū)后發(fā)生的一種非心源性肺水腫，如不及時救治，很有可能危及生命［5］。多年來科研人員對高原肺水腫的發(fā)病機制做了大量的研究，取得了長足進展和很多成果，但仍有一些不明之處。目前認為血管通透性增加是高原肺水腫發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大量水分進入肺泡而來不及重吸收導致肺水腫的發(fā)生。以往研究的重點偏向于低氧對高原肺水腫發(fā)生的影響，但在環(huán)境如此復雜的高原，低溫低氧復合因素的存在是不可忽視的。當機體急進高原環(huán)境的時候，首先呼吸加深加快，肺通氣、潮氣量和每分通氣量瞬時增加，可較安靜時增大上千倍，將有大量低溫低氧氣體進入呼吸道。由此，我們推想在急進高原時發(fā)生的高原肺水腫是否由于呼氣量的增加，導致肺微血管內(nèi)皮細胞瞬間感受大量低溫低氧氣體的傷害性刺激，從而導致血管內(nèi)皮損傷及其功能改變，進而誘發(fā)了高原肺水腫？因此，本實驗通過研究低溫低氧對PMVEC的損傷作用并分析其交互作用，以進一步探討兩因素在高原肺水腫發(fā)生中的作用。

血管內(nèi)皮細胞是血管內(nèi)壁覆蓋的一層上皮細胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機械屏障，對維持血管內(nèi)壁完整性、調(diào)節(jié)血管通透性、防止凝血和血栓形成等有重要作用。其中，血管內(nèi)皮細胞分泌的血管活性物質(zhì)NO、ET-1、VEGF在維持血管張力和內(nèi)皮細胞功能方面有重要作用。以往，研究人員傾向于選擇大血管內(nèi)皮細胞模擬進行心腦血管與其他器官血管疾病機制的研究，但隨著近年來各個器官微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法的成功建立，選擇疾病發(fā)生所在部位的微血管內(nèi)皮細胞能夠更好的模擬發(fā)病過程。肺微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于維持正常肺功能至關(guān)重要，在病理條件下，肺微血管內(nèi)皮細胞是炎癥反應(yīng)的主要靶細胞。因此，本實驗采用復合酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVEC）來進行低溫、低氧以及低溫低氧復合因素對其影響的研究，以探討高原肺水腫發(fā)生過程中低溫和低氧所起的作用。

首先，我們以乳酸脫氫酶（LDH）作為判斷細胞損傷的指標，LDH是一種廣泛存在于細胞漿中的糖酵解酶，當細胞膜受到損傷時，LDH從細胞中釋放到細胞外的量會增加，因此測定培養(yǎng)液中的LDH含量可客觀的衡量細胞的受損程度［6］。本次實驗結(jié)果顯示，低溫、低氧以及低溫低氧復合因素都會使細胞培養(yǎng)液中的LDH活性升高，且與低溫、低氧組相比，低溫低氧復合應(yīng)激組的LDH活性升高的更明顯。而析因方差分析結(jié)果顯示低溫和低氧在對細胞釋放LDH的影響上有協(xié)同作用。說明低溫和低氧在對細胞損傷作用上均有影響，而低溫低氧復合在一起造成的影響更嚴重。

血管內(nèi)皮細胞的功能是通過其分泌的一系列血管活性物質(zhì)實現(xiàn)的，如一氧化氮（NO）和內(nèi)皮素（ET）參與調(diào)節(jié)血管張力。NO是在血管內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶的作用下合成，有內(nèi)皮細胞釋放的血管活性物質(zhì)，具有較強的血管舒張作用［7］。ET是具有強大收縮作用的血管活性肽，分為三個亞型：ET-1、ET-2和ET-3，其中ET-1尤為重要，是目前已知的收縮血管作用最強的細胞因子。在生理狀態(tài)下，內(nèi)源性激動劑刺激內(nèi)皮細胞釋放的NO和ET-1相互作用，處于動態(tài)平衡而共同維持正常的血管張力，一旦這種平衡被打破，內(nèi)皮細胞功能就會出現(xiàn)障礙，表現(xiàn)為NO的減少或活性降低，而ET-1的釋放增加。這與本研究的結(jié)果相符，在低溫、低氧、低溫低氧復合條件下，PMVEC細胞釋放的NO大幅度減少而ET-1的mRNA表達則增加，并且低溫和低氧存在協(xié)同作用，低溫低氧復合因素作用于PMVEC細胞比單一因素作用更強。說明在低溫低氧條件的作用下，PMVEC細胞的功能受損，可能導致血管張力調(diào)節(jié)失常，血管收縮作用增強。

血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的糖蛋白，在促進內(nèi)皮細胞增殖和增加血管通透性方面起著關(guān)鍵作用［8］。有研究表明，在低氧條件下VEGFmRNA的表達上調(diào)［9］，VEGF再通過其他的多種途徑改變血管內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白的重新分布，導致毛細血管的通透性增加，可能是高原肺水腫發(fā)生的重要因素之一。另外有研究結(jié)果顯示，急性缺氧大鼠肺組織中的VEGF水平明顯的升高［10］。但關(guān)于低溫對體外細胞或組織中VEGF表達的影響尚無報道。本研究的結(jié)果顯示，在低溫、低氧和低溫低氧復合條件下，PMVEC細胞VEGFmRNA的表達均上調(diào)，并且低溫和低氧存在協(xié)同作用。VEGF的異常升高使得血管的通透性增加，大量血漿蛋白漏出，機體超負荷就會誘發(fā)肺水腫的發(fā)生。

綜上所述，本研究顯示，低溫和低氧兩個環(huán)境因素對PMVEC細胞均會產(chǎn)生損害作用，無論是在內(nèi)皮細胞功能還是細胞通透性方面，并且兩因素的共同作用下比單一因素對PMVEC細胞的損害作用更大，即低溫和低氧在對PMVEC細胞損傷作用上存在協(xié)同作用。PMVEC細胞功能受損是高原肺水腫發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。因此，我們有理由相信進入高原地區(qū)時的低溫低氧復合的環(huán)境因素是造成高原肺水腫發(fā)生的重要原因，在防治方面除了及時吸氧外還要注意防寒保暖措施的有利實施。

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