內(nèi)皮祖細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)VSMCs增殖、遷移及粘附功能的影響*

吳海燕，楚海榮，李 宏，唐可欣，靖 旭，孫金隆，尹青令，成 敏△

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東濰坊261053）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊形成和發(fā)展的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。增殖的VSMCs由血管中層向內(nèi)膜的遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜中VSMCs的大量積聚和結(jié)締組織的形成，進(jìn)而促進(jìn)新生內(nèi)膜形成和AS。通常情況下，體內(nèi)VSMCs處于靜息態(tài)，不會(huì)過度增生及向內(nèi)膜遷移。但當(dāng)內(nèi)皮損傷和功能障礙時(shí)，可致使中膜VSMCs的功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致新內(nèi)膜的形成，而內(nèi)皮細(xì)胞再生能夠阻止由VSMCs增生帶來的損害［1］。文獻(xiàn)證實(shí)除成熟內(nèi)皮細(xì)胞外，EPCs對(duì)維持內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用。大量研究表明，EPCs參與受損內(nèi)皮的修復(fù)不僅僅通過分化為內(nèi)皮細(xì)胞整合入受損處，還可通過旁分泌的方式釋放一些血管活性物質(zhì)，包括前列環(huán)素（prostaglandin I2，PGI2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、血管生長(zhǎng)因子（包括 VEGF，SDF-1，OGF-1，HGF）等［2，3］。為此，本研究觀察 EPC-CM對(duì) VSMCs增殖、粘附及遷移的影響，以期進(jìn)一步闡明EPCs對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，完善動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病的發(fā)病機(jī)制，為EPCs移植治療心血管系統(tǒng)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性SD大鼠，體重200 g左右（山東省濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；VEGF及 bFGF（peprotech）；M199、胎牛血清和胰蛋白酶（Hyclone）；Histopaque-1083（Sigma）；纖維連接蛋白（Roche）；Dil-LDL、FITCUEA（Molecular Probe），F(xiàn)ITC-CD133、vWF-FITC及CD31-PE（BD）；Cell Counting Kit試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；Boyden小室（江蘇海門麒麟儀器廠）。

1.2 EPCs分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 EPCs分離培養(yǎng) 健康雄性SD大鼠，斷頸處死，75%酒精浸泡10min后，無菌PBS沖洗長(zhǎng)骨骨髓腔。Histopaque-1083密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，按105cells／cm2密度接種于預(yù)先包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，使用15%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，4 d后更換培養(yǎng)基。

1.2.2 EPCs的鑒定 貼壁細(xì)胞在37℃含Dil-LDL培養(yǎng)基中孵育4 h，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。再將FITC-UEA加于上述標(biāo)本，37℃孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察，紅色和綠色雙染色細(xì)胞為EPCs。流式細(xì)胞術(shù)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測(cè) CD133，vWF及 CD31的表達(dá)。

1.3 VSMCs分離培養(yǎng)和鑒定

無菌分離大鼠胸主動(dòng)脈，縱向剖開，去除動(dòng)脈外膜和內(nèi)皮，將動(dòng)脈中層剪成1mm×1mm小塊，按每平方厘米3～5塊的密度種植于玻璃培養(yǎng)瓶。粘有植塊的瓶底朝上，放置6 h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使植塊慢慢浸入培養(yǎng)基中。4～7 d，植塊周圍即可長(zhǎng)出細(xì)胞，待細(xì)胞融合成片，常規(guī)消化傳代。3～5代VSMCs用于實(shí)驗(yàn)。VSMCs鑒定采用α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）染色陽性，以及形態(tài)學(xué)典型的“峰和谷”樣生長(zhǎng)狀態(tài)判定。

1.4 EPCs條件培養(yǎng)基（EPCs-CM）的制備

傳代后的EPCs在底面積為25 cm2培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)融合后，再繼續(xù)培養(yǎng)3 d，用 PBS（pH 7.4）洗 3次，換成無血清M199培養(yǎng)基4ml，24 h后收集培養(yǎng)基，1 500 r／min離心 5 min，取上清液即為 EPC-CM。EPC-CM經(jīng)0.22μm濾膜過濾，貯存于-80℃冰箱中，備用。實(shí)驗(yàn)中以無血清的M199培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.5 CCK-8試劑盒檢測(cè)VSMCs增殖

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs，按2×105cells／ml密度接種至12孔板。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，用2%胎牛M199同步化12 h，然后以無血清M199或EPC-CM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，接種細(xì)胞懸液100μl（約5 000-10 000個(gè)細(xì)胞）于96孔板內(nèi)，每組種5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合80%左右，棄去各孔培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液（按1∶10比例），在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30～60 min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.6 VSMCs粘附功能的觀察

VSMCs經(jīng)上述方法處理后，按 2×105cells／ml密度接種至包被有人纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)30 min，PBS洗滌去除未貼壁細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取9個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.7 改良Boyden小室檢測(cè)VSMCs遷移能力

按上述方法收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將200μl培養(yǎng)液加入改良的Boyden小室的下室，50μl VSMCs（2×104）懸浮液注入上室，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。8 h后，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3～4次。采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs培養(yǎng)和鑒定

剛分離的單個(gè)核細(xì)胞大多呈懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)4 d后，貼壁細(xì)胞數(shù)量增多且呈梭形，培養(yǎng)7 d的細(xì)胞有集落樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，培養(yǎng)21 d的細(xì)胞呈明顯鋪路石樣外觀（圖1A-C）。Dil-ac-LDL和 FITC-UEA-1染色呈雙陽性表現(xiàn)（圖1D-F），F(xiàn)ACS結(jié)果顯示：干細(xì)胞標(biāo)志物CD133陽性細(xì)胞率較低，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF及CD31陽性細(xì)胞率較高（圖1G，圖1見彩圖頁Ⅱ）。

Fig. 1 Characterization of EPCs derived from rat bone marrow（A-F ×100）

Fig. 2 VSMCs morphology and identification（A and B ×100，C ×400）

2.2 VSMCs培養(yǎng)和鑒定

培養(yǎng)4～7 d，細(xì)胞以垂直方向從組織塊邊緣游離出，向外生長(zhǎng)形成細(xì)胞暈，進(jìn)而形成細(xì)胞簇。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多形性，如長(zhǎng)梭形、三角形或不規(guī)則形，折光性強(qiáng)，有長(zhǎng)短不一的胞突（圖2A）。細(xì)胞密度高時(shí)呈典型的“峰-谷”生長(zhǎng)（圖2B）。免疫熒光的鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)的VSMCs表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性α-SMA（圖2C，圖2見彩圖頁Ⅱ）。

2.3 EPC-CM對(duì)VSMCs增殖的影響

CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示：EPC-CM處理組與無血清M199培養(yǎng)基（對(duì)照組）比較，其OD值顯著降低（P＜0.01，圖 3），提示 EPC-CM抑制了 VSMCs的增殖。

Fig.3 EPC-CM decreased VSMC proliferation（±s，n＝5）

2.4 EPC-CM對(duì)VSMCs粘附的影響

粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與無血清M199培養(yǎng)基培養(yǎng)的VSMCs相比，EPC-CM處理抑制了VSMCs的粘附（P＜0.01，圖 4）。

Fig.4 EPC-CM inhibited VSMC adhesion（±s，n＝9）

2.5 EPC-CM對(duì)VSMCs遷移的影響

Boyden小室檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，EPC-CM條件培養(yǎng)基顯著抑制VSMCs遷移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 5見彩圖頁Ⅱ）。

Fig. 5 EPC-CM impaired VSMC migration（x ± s，n=5）

3 討論

AS所致的心、腦血管疾病是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居各種疾病之首。研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是其始動(dòng)因素，當(dāng)血管損傷后，中膜的VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，相對(duì)穩(wěn)定的VSMCs進(jìn)行增殖，隨之大量VSMCs遷移至內(nèi)膜，導(dǎo)致血管受損處大量VSMCs的粘附，血管壁變厚，彈性降低，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化和新生內(nèi)膜的形成［4］。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷勢(shì)必誘發(fā)機(jī)體一系列反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，以實(shí)現(xiàn)受損內(nèi)皮的重新內(nèi)皮化。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為損傷周邊的內(nèi)皮細(xì)胞可通過遷移、增殖來修復(fù)內(nèi)皮缺損。但成熟內(nèi)皮細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，其增殖潛能有限，修復(fù)能力并不理想［5］。EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，出生后EPCs主要存在于骨髓，缺血及血管內(nèi)皮損傷等因素可以促進(jìn)EPCs由骨髓動(dòng)員到外周血中，遷移并粘附到損傷處［6］。實(shí)驗(yàn)證實(shí) EPCs移植在冠心病、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等血管性疾病中發(fā)揮了積極的治療作用，表現(xiàn)為降低血管損傷后血管內(nèi)膜增殖、預(yù)防支架植入術(shù)后支架內(nèi)血栓形成和再狹窄等［7］，提示：EPCs可能抑制 VSMCs的病理性增殖及功能。方立等［8］實(shí)驗(yàn)表明EPCs與VSMCs共培養(yǎng)可抑制后者增殖。然而EPCs如何參與調(diào)控VSMCs功能尚不清楚。最近研究［9］證實(shí)：EPCs的許多生物學(xué)功能主要是通過其旁分泌實(shí)現(xiàn)的。而檢測(cè)其旁分泌作用對(duì)細(xì)胞的影響，最簡(jiǎn)單的方法就是使用“條件培養(yǎng)基”，就是將一種細(xì)胞（細(xì)胞A）的條件培養(yǎng)基（含該細(xì)胞分泌物或代謝產(chǎn)物）作用于另一種細(xì)胞（細(xì)胞B），觀察其對(duì)細(xì)胞 B相關(guān)功能的影響［10］。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用 EPC-CM培養(yǎng) VSMCs，結(jié)果顯示 EPCCM作用VSMCs 24 h以后，VSMCs的增殖、遷移和粘附能力均受到抑制。

理論上講，條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞功能起負(fù)調(diào)節(jié)還是正調(diào)節(jié)作用，是由條件培養(yǎng)基中刺激活性物質(zhì)和抑制活性物質(zhì)之間的平衡決定。在本實(shí)驗(yàn)條件下，EPC-CM中抑制活性可能占優(yōu)勢(shì)，因此表現(xiàn)為對(duì)VSMCs功能的負(fù)性調(diào)控作用，這與生理狀態(tài)下體內(nèi)VSMCs處于靜止和非增殖狀態(tài)相符合。然而EPCCM影響VSMCs相關(guān)功能的確切機(jī)制，EPCs分泌的何種生物活性物質(zhì)在其中發(fā)揮主導(dǎo)作用，以及是通過哪些途徑來發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究，將有助于我們進(jìn)一步揭示AS的發(fā)病機(jī)制，并為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（PTCA）術(shù)后再狹窄的治療提供新的思路。

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