菊米提取液對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的抑制作用*

況 煒，陳慧玲，蔣建平

（1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波315100；2.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，杭州310053）

宮頸癌作為女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌。目前，宮頸癌的治療手段包括手術(shù)、放化療、靶向治療及中草藥治療等。多項(xiàng)研究表明［1-3］，宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)多種傳統(tǒng)中草藥及其有效成分敏感，如中藥復(fù)方兒黃散、新木脂素、白花蛇舌草等分別通過下調(diào)Bcl-2蛋白、Mcl-1蛋白和Ki-67蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡；白樺脂酸則通過上調(diào)caspase-3、Cyto c蛋白表達(dá)而促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。

菊米為菊科植物甘野菊（chrysanthemum seticuspe）的花蕾制作而成。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)菊米提取液中的成分如小白菊內(nèi)酯、木犀草素、芹菜素、萜類化合物等具有舒張血管、對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷、抑制腫瘤細(xì)胞（如肝癌SMMC-7721、結(jié)腸癌SW620細(xì)胞）的增長并誘導(dǎo)其凋亡等作用［4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，研究菊米提取液對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長的抑制作用，并將不同濃度的菊米提取液與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察藥物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為中藥抗實(shí)體腫瘤及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 RPMI 1640（roswell park memorial institute1640）細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、二甲基亞砜（DMSO）及噻唑藍(lán)（thiazole blue，MTT）均購自 Sigma公司，caspase-3／7、caspase-6活性檢測(cè)試劑盒購自 Promega公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）、酶聯(lián)檢測(cè)儀（Bio-Tek統(tǒng)一名稱ELX800）、多功能分辨熒光儀 1420（Wallac 1420）均購自美國。

1.1.2 藥物制備 野菊米購自遂昌華昊菊米有限公司。菊米提取液的制備：取干的野菊米加入10倍的無水乙醇室溫萃取24 h，過濾去沉淀，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后，用DMSO溶解，依次制備成1、2、5和10 mg／ml 4個(gè)濃度的母液。臨用前再用含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋1 000倍，制成相應(yīng)的工作液（其中DMSO濃度為0.1%）。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素及100μg／ml鏈霉素的 RPMI 1640完全培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株 HeLa。0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA消化、傳代細(xì)胞。選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB／c-nu裸鼠50只，雌性，4～6周齡，體重18～22 g，購自杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，保持恒定的濕度（40～80）%、溫度（22～25）℃，經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動(dòng)物自由飲食。裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠宮頸癌移植模型的建立 取處于對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，PBS沖洗，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞存活率大于95%；制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至2×107cells／ml。在每只裸鼠右肩背部皮下注射0.2 ml單細(xì)胞懸液。動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境內(nèi)。待腫瘤長出后，每日測(cè)量腫瘤體積，7 d后所有裸鼠均出現(xiàn)大于100mm3的皮下結(jié)節(jié)，成瘤率為100%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 接種后第8天將成瘤裸鼠隨機(jī)分為5組（n＝10）。（1）對(duì)照組：荷瘤鼠不加以治療，繼續(xù)飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；（2）藥物組：根據(jù)菊米提取液濃度不同又分為 4組（0.001、0.002、0.005、0.01mg／ml）。取不同濃度的菊米提取液灌胃，每只荷瘤鼠每天一次，每次胃內(nèi)灌藥5ml／kg，共14 d。

1.2.3 瘤體抑制率計(jì)算 實(shí)驗(yàn)結(jié)束將荷瘤鼠處死后，完整剝出瘤組織，測(cè)量各組裸鼠移植瘤的長度、寬度和高度，腫瘤體積＝（長×寬×高）／2，取瘤體積的均值（cm3）。瘤體抑制率（%）＝［1-（藥物組瘤體積／對(duì)照組瘤體積）］×100

1.2.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率 用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至3×104cells／ml，180 μl／well（6×103個(gè)左右細(xì)胞量）接種于 96孔板中，16 h后給予各種不同處理，分為對(duì)照組（含終濃度為0.1%DMSO完全培養(yǎng)液培養(yǎng)）和4個(gè)不同濃度藥物組（0.1%DMSO完全培養(yǎng)液中分別含 0.001、0.002、0.005、0.01mg／ml菊米培養(yǎng)液培養(yǎng)），并于 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后各孔中按1∶9加入5mg／ml MTT（用 pH 7.4 PBS配制），再置 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入DMSO 150μl／well，搖床 30min后，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上 570 nm波長處測(cè)吸光度（A）值，以A值間接反映存活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1-A給藥／A對(duì)照）×100

1.2.5 細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用PI單染分析法，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期以反映細(xì)胞凋亡情況。收集各處理組細(xì)胞，均勻打散，PBS沖洗3次后于70%乙醇中 4℃固定 18 h，洗去乙醇，加入 RNase（50mg／ml）消化并用 PI（100mg／ml）染色 30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體凋亡峰，根據(jù)此亞二倍體峰計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

1.2.6 Caspase-3／7，caspase-6活性分析 具體操作根據(jù)Promega試劑盒說明書，即將細(xì)胞均勻接種于96孔板中，給予不同處理后，各孔加入與培養(yǎng)基等體積的 caspase-3／7，caspase-6發(fā)光底物（分別為 ZDEVD-R110，Z-VEID-氨基熒光素），輕輕搖勻 30 s，室溫孵育3 h后于多功能分辨熒光儀上測(cè)量熒光值（relative light units，RLU）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并用Sigma Sata軟件包處理，采用單因素方差分析（Ono-way ANOVA）和 Student-Newman-Keuls（SNK）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 菊米提取液對(duì)體內(nèi)HeLa細(xì)胞成瘤體積的影響

各組荷瘤鼠經(jīng)不同濃度菊米提取液（0.001～0.01mg／ml）連續(xù)灌胃給藥 14 d后，與對(duì)照組相比，除了0.001 mg／ml藥物濃度組外，其余各組荷瘤鼠背部皮下移植瘤體積均有縮小，瘤體抑制率呈劑量依賴性增長（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Effectof Jumiextraction on inhibition rate of tumor volume inmice（±s，n＝10）

Tab.1 Effectof Jumiextraction on inhibition rate of tumor volume inmice（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

（mg／ml）Tumor volume（cm3）Inhibition rate of tumor volume（%）Group 94.16±3.97 Control — 1.7934±0.2885 —0.001 1.5226±0.4116 15.90±4.23 0.002 0.7286±0.4791* 56.46±9.20 Drug 0.005 0.2955±0.1429** 82.97±9.70 0.010 0.1031±0.0103**

2.2 菊米提取液對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

含不同濃度菊米提取液（0.001～0.01 mg／ml）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組相比，菊米提取液對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率逐漸上升，IC50（半數(shù)抑制濃度）為 0.004 mg／ml，且與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（r＝0.9554），0.01 mg／ml時(shí)對(duì) HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最大，達(dá)到（67.53±1.15）%（P＜0.05，表 2）。

Tab.2 Effect of Jumi extraction on inhibition rate of cell viability（±s，n＝4）

Tab.2 Effect of Jumi extraction on inhibition rate of cell viability（±s，n＝4）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

（mg／ml） A570（nm） Inhibition rate of cell viability（%）Group 67.53±1.15 Control — 1.5515±0.0712 —0.001 1.1745±0.1443** 24.46±6.72 0.002 0.9735±0.0384** 37.11±4.71 Drug 0.005 0.6980±0.0296** 54.98±1.93 0.010 0.5035±0.0199**

2.3 菊米提取液對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

HeLa細(xì)胞與含有菊米提取液（0.001～0.01 mg／ml）的完全培養(yǎng)基或不含提取液的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h后，收集全部培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。不含提取液對(duì)照組細(xì)胞凋亡發(fā)生率為（2.00±0.03）%，含菊米提取液 0.001、0.002、0.005、0.01 mg／ml的藥物組細(xì)胞凋亡率分別為 （6.33±1.90）%、（9.73±1.32）%、（12.80±0.80）%、（31.00±4.01）%。與對(duì)照組相比，四個(gè)濃度藥物組細(xì)胞凋亡率均顯著提高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性（P＜0.05，圖 1）。

2.4 菊米提取液對(duì)caspase-3／7、caspase-6酶活性的影響

HeLa細(xì)胞與含有菊米提取液（0.001～0.01 mg／ml）的完全培養(yǎng)基或不含提取液的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組相比，除0.001 mg／ml濃度藥物組，其余三個(gè)濃度藥物組的caspase-3／7、caspase-6酶活性均有顯著增加，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01，圖 2、圖 3）。

Fig.1 Effectof Jumiextraction on cell apoptosis（±s，n＝3）

Fig.2 Effectof Jumiextraction on caspase-3／7 enzyme activity（±s，n＝3）

Fig.3 Effectof Jumiextraction on caspase-6 enzyme activity（±s，n＝3）

3 討論

我國宮頸癌的發(fā)病率及死亡率均列女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤的第二位，且其發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。由于宮頸癌對(duì)于化療不敏感，故現(xiàn)有的治療手段以手術(shù)和放療為主，但對(duì)于腫瘤細(xì)胞已擴(kuò)散的中晚期患者，手術(shù)和放療的效果均不理想。因此，具有選擇性高、作用強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為宮頸癌研究的重要任務(wù)之一。中藥因其安全性較高及副作用少等特點(diǎn)，被用于癌癥患者尤其是中晚期患者的治療，可減輕放、化療的不良反應(yīng)，提高癌癥患者的生活質(zhì)量，延長生存期。菊米具有多種獨(dú)特的藥理作用，如增強(qiáng)免疫力、清火明目、抗菌消炎平肝、降血壓等。菊米提取液含有豐富的黃酮、蛋白質(zhì)、菊米內(nèi)酯、野菊花素等營養(yǎng)成分，也含有小白菊內(nèi)酯、萜類化合物、芹菜素、木犀草素等成分，已被證實(shí)具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用，但菊米提取液對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用及機(jī)制尚不明確。本研究一方面通過建立人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察菊米提取液對(duì)HeLa細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響；另一方面通過菊米提取液與HeLa細(xì)胞共同孵育，觀察藥物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的菊米提取液（0.001～0.01 mg／ml）在荷瘤鼠體內(nèi)可明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長。隨著菊米提取液劑量的增大，移植瘤體積逐漸減??；與空白對(duì)照組比較，除最低濃度藥物組外（0.001 mg／ml），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；瘤體抑制率則逐漸增大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菊米提取液在裸鼠體內(nèi)可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

本研究采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率，結(jié)果顯示：隨著菊米提取液濃度的增大（0.001～0.01mg／ml），間接反映存活細(xì)胞數(shù)量的吸光度值逐漸減小，與對(duì)照組相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；細(xì)胞增殖抑制率則逐漸增大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菊米提取液在體外與細(xì)胞共同孵育可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：隨著菊米提取液濃度的增大（0.001～0.01 mg／ml），細(xì)胞凋亡率由 6.33%升至 31.00%，各藥物組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菊米提取液在體外與細(xì)胞共同孵育可促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

本研究采用比色法測(cè)定 caspase-3／7酶和 caspase-6酶活性，結(jié)果顯示：隨著菊米提取液濃度的增大（0.001～0.01mg／ml），caspase-3／7酶活性升高，各藥物組 caspase-3／7酶活性分別為對(duì)照組的 1.33、1.87、2.09、2.95倍；caspase-6酶活性亦逐步升高，各藥物組 caspase-6酶活性分別為對(duì)照組的 1.10、1.57、1.76、1.96倍。分別與對(duì)照組比較，除最低濃度藥物組（0.001mg／ml）外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，菊米提取液可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長。

細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下的一個(gè)嚴(yán)密完整的程序過程，它是細(xì)胞自主性死亡過程［5］。腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)紊亂引起的細(xì)胞增殖與死亡的平衡失調(diào)，是導(dǎo)致人類多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。細(xì)胞凋亡的主要途徑有兩條，一是通過胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase，二是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。Caspase家族在凋亡過程中起到關(guān)鍵性的作用，其可分為兩類，一類為啟動(dòng)者如caspase-8、9，接受刺激后能通過自剪接而激活，然后引起 caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一類為執(zhí)行者 caspase-3，可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡。Caspase-3、caspase-7與 caspase-6是主要的處于細(xì)胞凋亡下游的凋亡效應(yīng)分子。Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，是細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志，其活化及活性受到多種因素的調(diào)節(jié)［6］。Caspase-7與 caspase-3在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程存在正相關(guān)，但在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中caspase-7與caspase-3的相互關(guān)系并未明確［7］。Caspase-6參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行并可降低凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的閾值，其與caspase-3有38%同源性，二者是不同凋亡途徑共同的下游路徑。Caspase-3蛋白早于caspase-6蛋白的激活，并可促使caspase-6蛋白活化，活化的 caspase-6蛋白又能進(jìn)一步活化caspase-3蛋白，形成對(duì)caspase-3蛋白活化的正性循環(huán)，但二者的具體調(diào)控機(jī)制及相互關(guān)系并不十分清楚［8］。結(jié)合本研究caspase-3／7酶和caspase-6酶活性結(jié)果，提示caspase-3／7基因和caspase-6蛋白基因的蛋白翻譯水平同樣可能是菊米提取液的作用位點(diǎn)，菊米提取液可能通過增加caspase-3／7、caspase-6蛋白表達(dá)、活化而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

目前關(guān)于菊米提取液抗宮頸癌機(jī)制的相關(guān)研究還不多。本研究顯示，菊米提取液能抑制宮頸癌細(xì)胞系HeLa增殖，誘導(dǎo)其凋亡，這是菊米提取液發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一，但是否還存在其他作用途徑，有待進(jìn)一步研究。

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