HPLC法測定升麻葛根顆粒中葛根素的含量 *

李建華，胡 倩，申慶亮

(1.武警河南總隊醫(yī)院，河南鄭州450052;2.濟(jì)寧神農(nóng)中醫(yī)藥研究所，山東兗州272100)

升麻葛根顆粒是從仲景葛根湯化裁而來［1］，是由升麻、葛根、赤芍、甘草為原料，經(jīng)提取、濃縮，加蔗糖、淀粉為輔料制成的中藥復(fù)方制劑，具有解肌透疹、和營解毒的作用［2］，用于麻疹欲發(fā)而不暢或發(fā)而不透，是幫助透疹的常用方劑［3－5］，臨床運(yùn)用范圍廣。升麻葛根顆粒處方中葛根為主藥，葛根中主要含葛根素［6］，葛根素是葛根的主要藥理活性成分。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究選擇葛根素為含量測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定其含量。

1 藥品、試劑與儀器

升麻葛根顆粒，自制，批號20111207，20111103，20111015。葛根素，化學(xué)對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，批號110752－200608;甲醇，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號SP0050;水，為重蒸餾水，自制。LC－10ATVP高效液相色譜儀;SPD－10VP紫外檢測器，日本島津公司產(chǎn)品;N－2000雙通道數(shù)據(jù)工作站，浙江大學(xué)智能信息工程研究所提供;FA－1004電子分析天平，上海天平儀器公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ODS C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相為甲醇－水(25∶75);檢測波長250 nm，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。在上述條件下，理論板數(shù)按葛根素計算不低于2000。

2.2 溶液的制備

對照品溶液的制備:精密稱取葛根素對照品8.01 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密吸取5 mL于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備:取升麻葛根顆粒適量，研細(xì)，混勻。取粉末約0.8 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，超聲處理20 min，放至室溫，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液的制備:按處方自制不含葛根的升麻葛根顆粒100 g，取適量按供試品溶液制備方法制備缺葛根陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、缺葛根陰性對照品溶液各20 μL，依次進(jìn)樣，測定，記錄色譜圖，見圖1～3。供試品色譜中，與對照品在相同的保留時間位置上有對應(yīng)的吸收峰出現(xiàn)，缺葛根陰性對照色譜則在相對應(yīng)的位置上無相應(yīng)的吸收峰檢出。結(jié)果表明，本品中除葛根外的其他藥物對含量測定無影響。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取葛根素對照品8.01 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1，2，5，7，10 mL 置 10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL，以葛根素的峰面積(A)對質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y=69 608X+171 719，R2=0.999 8。結(jié)果表明，葛根素在濃度16.02～160.20 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見表1、圖4。

圖1 葛根素對照品HPLC色譜圖

表1 線性關(guān)系考察試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗

取批號為20111103的升麻葛根顆粒5 g，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，按2.2項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣 6次。結(jié)果顯示，平均峰面積為4 835 124，RSD=0.77%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取批號為20111207的升麻葛根顆粒5 g，研細(xì)，按2.2項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，放置不同時間，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并計算結(jié)果。結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，平均峰面積4740632，RSD=0.86%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

分別精密稱取本品(批號20111103)約0.8 g，共6份，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，分別測定其含量。結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗測定數(shù)據(jù)

表3 重復(fù)性試驗測定數(shù)據(jù)

2.8 加樣回收率試驗

取批號為20111103的樣品約0.8 g，精密稱定，按2.2項下供試品制備方法操作，制備供試品溶液，測定葛根素的含量為3.1589 mg/g。另取同批次樣品約0.4 g，共9份，精密稱定，分別加入葛根素對照品1.5 mg(精密稱取葛根素對照品15 mg置20 mL量瓶中加甲醇溶解并定容至刻度，精密量取2 mL樣品中)，置50 mL量瓶中，按供試品溶液的制備方法制成加樣回收供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和加樣回收供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

加樣回收率=(測得總量－樣品含量)/加入量×100%。

結(jié)果表明，葛根素加樣平均回收率為99.93%，RSD值為0.60%，符合含量測定方法學(xué)驗證的有關(guān)技術(shù)要求。

2.9 樣品含量測定及含量限度的確定

精密稱取葛根素對照品適量，加甲醇 －水(25∶75)制成每mL含0.08 mg的葛根素溶液，作為對照品溶液。取本品粉末約0.8 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入流動相，用流動相稀釋至刻度，超聲處理20 min，放冷，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取上述兩種溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

表5 樣品測定結(jié)果

取3批樣品，每批3份，葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.12～3.19 mg/g，考慮到葛根素的轉(zhuǎn)移率，規(guī)定本品每克含葛根以葛根素(C21H20O9)計，不得少于3.00 mg。

3 小結(jié)

本研究參照2010版《中華人民共和國藥典》一部藥材標(biāo)準(zhǔn)中葛根素含量測定方法進(jìn)行檢測，用HPLC法測定升麻葛根顆粒中葛根素的含量，靈敏度高，樣品預(yù)處理簡單，有效成分分離良好，且其他成分無干擾，可控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

［1］黃榮宗，陳煥泓，吳大真.醫(yī)方臨癥指南［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1999.

［2］牛忻群.加味升麻葛根湯治療麻疹17例［J］.安徽中醫(yī)臨床雜志，1996，8(4):176.

［3］陳翠英.升麻葛根湯的臨床應(yīng)用體會［J］.肇慶醫(yī)藥，1999，2(32):32.

［4］江英能.加減升麻葛根湯治療嬰幼兒秋季腹瀉39例［J］.新中醫(yī)，1998，30(6):14.

［5］鄭通美.升麻葛根湯治療頭面部疾病體會［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2004，20(12):709.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.