高效液相色譜法測定老年咳喘片中淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量

王曉燕

(河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州450003)

老年咳喘片是由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補骨脂等7味中藥組成，具有滋陰壯陽、扶正固本、提高免疫能力、促進病體康復(fù)的功效，用于老年慢性支氣管炎及各種體虛癥［1］。原標準收載于部頒標準《中藥成方制劑》第九冊，無定量檢測方法。淫羊藿和補骨脂是方中用量較大的重要藥物。淫羊藿屬植物的化學(xué)成分目前報道有70多種，主要是黃酮類，如淫羊藿苷。淫羊藿苷除具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效外，還有鎮(zhèn)咳、祛痰與平喘作用［2］。王淑云［3］研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂中的香豆素類可明顯提高過敏性哮喘閾，對哮喘有明顯的拮抗作用。補骨脂素和異補骨脂素即屬呋喃香豆素類成分。有關(guān)老年咳喘片中淫羊藿苷的含量測定［4－5］及補骨脂素、異補骨脂素的含量測定均有報道［6］?，F(xiàn)建立本品中補骨脂和淫羊藿兩味藥材的檢測方法，同時測定淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，以快速有效地控制老年咳喘片的質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

老年咳喘片，鄭州羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號110104，110105，110106。淫羊藿苷對照品(批號110737－200114)、補骨脂素對照品(批號110739－200613)、異補骨脂素對照品(批號110738－200309)，均由中國藥品生物制品檢定所提供，均為含量測定用;水為高純水。Waters 2690高效液相色譜儀，Waters 996二極管陣列檢測器，均為美國Waters公司產(chǎn)品;M32色譜工作站。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HypersIL C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，柱溫40℃，流動相為乙腈－1g/L磷酸(30∶70)，體積流量1.0 mL/min，檢測波長260 nm，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂對照品適量，制成含量分別為 0.132 8，0.036 6，0.037 8 g/L的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品40片，除去薄膜衣，研細。取約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量;置水浴上加熱回流40 min，放冷;再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項下混合對照品溶液3，5，7，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，按上述條件分別測定峰面積積分值，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，進行回歸處理。結(jié)果:淫羊藿苷進樣量在0.398 4～2.656 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=1.626×106X －37 402，r=0.999 7;補骨脂素進樣量在0.109 8～0.732 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3.012×106X－24 186，r=0.999 7;異補骨脂素進樣量在0.113 4～0.756 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3.60×106X －33 556，r=0.999 8。

2.5 陰性對照試驗

分別取方中缺淫羊藿和補骨脂外其他藥物，按老年咳喘片處方比例和工藝分別制備缺淫羊藿和缺補骨脂陰性對照物，按供試液制備方法制成缺淫羊藿陰性對照液和缺補骨脂陰性對照液。分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行分析，見圖1。結(jié)果:供試品溶液色譜中，在與淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品色譜相應(yīng)的位置上有吸收峰，而缺淫羊藿和缺補骨脂陰性對照溶液則在相應(yīng)的保留時間無吸收峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，其他藥物對含量測定無影響。

圖1 含量測定HPLC色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗

取批號110104的樣品，按上述方法制備供試品溶液，吸取10 μL，分別在 0，2，4，6，8 h 注入液相色譜儀，測其峰面積，取8 h的測定結(jié)果。結(jié)果:淫羊藿苷的平均峰面積為2 032 098，RSD=0.43%;補骨脂素的平均峰面積為614 933，RSD=0.32%;異補骨脂素的平均峰面積為1010 723，RSD=0.29%。

2.7 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果:淫羊藿苷平均峰面積為2 014 610，RSD=1.21%;補骨脂素平均峰面積為609 852，RSD=1.28%;異補骨脂素平均峰面積為1 009 521，RSD=1.18%。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品(批號110104)，制備6份供試品溶液，按上述方法重復(fù)平行測定。結(jié)果:淫羊藿苷平均含量為0.631 mg/g，RSD為2.01%;補骨脂素平均含量為0.118 9 mg/g，RSD為2.32%;異補骨脂素平均含量為0.145 mg/g，RSD為2.29%。

2.9 回收率試驗

取已知含量的樣品(淫羊藿苷含量為0.631 mg/g，補骨脂素含量為0.118 9 mg/g，異補骨脂素含量為0.145 0 mg/g)，研細，取約2.5 g，精密稱定;精密加入淫羊藿苷對照品約1.5 mg，補骨脂素對照品溶液(0.366 g/L)和異補骨脂素對照品溶液(0.378 g/L)各1 mL及甲醇23.0 mL;按2.3項下供試品溶液制備方法操作，制成加樣供試品溶液。吸取加樣供試液10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測定加樣供試液中含量，計算回收率。結(jié)果見表1～3。

表1 淫羊藿苷回收率試驗結(jié)果

表2 補骨脂素回收率試驗結(jié)果

表3 異補骨脂素回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品測定

取3批樣品，按2.3項下方法操作，制備供試品溶液，依法測定，重復(fù)測定3次，結(jié)果見表4。

表4 3批樣品含量測定結(jié)果 n=3

3 討論

在本試驗中，曾試用甲醇 －水(50∶5 0)，甲醇－1 g/L磷酸溶液(50∶50)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(40∶60)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(35∶65)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(30∶70)等條件，經(jīng)反復(fù)比較，最終確定乙腈－1g/L磷酸溶液(30∶70)為最佳色譜條件，色譜重復(fù)性好，3種待測成分出峰時間適宜，峰形對稱，且與相鄰峰分離度較好。

筆者對提取方法和提取時間也進行了考察。分別用乙醇超聲、乙醇回流和甲醇回流進行提取制備的供試品，測定含量結(jié)果顯示，甲醇回流提取待測成分含量最高。分別測定了回流提取30，40，50 min制備的供試品，結(jié)果顯示，提取40 min制備的供試品溶液含量最高，加熱回流50 min時各成分含量明顯下降。因此，最終選擇甲醇加熱回流40 min的提取方法制備供試品溶液。

本實驗中分別對淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素色譜峰進行吸收光譜掃描，結(jié)果淫羊藿苷在270 nm下有最大吸收，補骨脂素和異補骨脂素在246 nm下有最大吸收。此與2010版《中國藥典》一部中淫羊藿和補骨脂藥材項下的測定波長一致。因此，選擇 0 ～15 min、270 nm 和15 ～25 min、246 nm分別作為淫羊藿苷與補骨脂素、異補骨脂素的檢測波長。采用M32色譜工作站的定時波長功能，選取15 min為檢測波長轉(zhuǎn)換點，使檢測波長由270 nm變?yōu)?46 nm，在同一色譜條件下同時檢測本品中淫羊藿苷和補骨脂素類成分。此法不僅可以用于DAD檢測器，也可用于普通的多波長紫外檢測器，具有普遍適用性，方便快速。

采用高效液相色譜法同時測定老年咳喘片中淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，方法簡便、快捷、重現(xiàn)性好，可更科學(xué)、更全面的對老年咳喘片進行質(zhì)量評價。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥品標準中藥成方制劑:第九冊［S］.1994:70.

［2］李花.淫羊藿藥理作用的研究現(xiàn)狀及展望［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(22):3413.

［3］王淑云.補骨脂的藥理作用研究概況［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(6):1081.

［4］李志紅，付彬，石國明.高效液相色譜法測定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中國藥業(yè)，2010，19(6):28.

［5］劉燦輝，譚浩軍.高效液相色譜法測定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中國藥業(yè)，2009，18(18):39.

［6］覃建明，莫文電，譚忠謀.RP－HPLC法測定老年咳喘片中補骨脂和異補骨脂的含量［J］.世界中醫(yī)藥，2010，5(3):75.