壽胎丸對大鼠卵巢移植術(shù)后體質(zhì)量及E2 分泌的影響*

朱淑惠，羅頌平，鄧煜燎

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣東 廣州510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科教研室，廣東 廣州510405)

卵巢是女性重要的生殖和內(nèi)分泌器官，隨著20 世紀90 年代卵巢冷凍保存技術(shù)和移植免疫學(xué)的發(fā)展，卵巢移植受到醫(yī)者越來越多的重視。影響移植成功的關(guān)鍵在于控制移植后的排斥反應(yīng)，延長移植卵巢的存活時間。近年來，隨著中藥免疫藥理研究的逐漸深入，中藥抗移植排斥作用的研究也取得了一定的進展。壽胎丸出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠4 味中藥組成，具有補腎氣、固沖任、調(diào)氣血、安胎的作用。壽胎丸用于抗器官移植后免疫排斥反應(yīng)的思路主要源于對反復(fù)自然流產(chǎn)的治療。對于母體而言，胎兒相當于同種半異體移植物，而自然流產(chǎn)可視為母體對胎兒的一種免疫排斥反應(yīng)。本課題建立SD 和Wistar 大鼠間同種異體卵巢移植模型，并建立Wistar 大鼠自體卵巢移植模型作對照，觀察補腎復(fù)方壽胎丸對同種大鼠自體及異體卵巢移植的影響，從移植模型體質(zhì)量及雌二醇(E2)的變化來探討補腎復(fù)方壽胎丸抗卵巢移植排斥反應(yīng)的機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

Wistar 大鼠210 只，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為0047261，0048981，0049554，0050275，0050721，0050814。SD 大鼠120 只，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為0049729，0051023。大鼠均為雌性，SPF 級，10～12周齡，體質(zhì)量180～230 g，飼養(yǎng)于SPF 級實驗室，照明時間12 h/d(8:00—20:00)，相對濕度55% ±10%，溫度(22 ±2)℃，以消毒大鼠專用飼料和潔凈水飼養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

壽胎丸由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠4 味中藥組成，均購于康美藥業(yè)有限公司。每劑含生藥材200 g，按菟絲子∶桑寄生∶續(xù)斷∶阿膠=4 ∶3∶3∶1的比例，將菟絲子、桑寄生、續(xù)斷3 味藥加水750 mL，煎至150 mL，阿膠烊化，濃縮至100 mL，含生藥量2 g/mL。環(huán)孢A(CsA，新賽斯平軟膠囊)，25 mg/粒，杭州中美華東制藥有限公司產(chǎn)品，批號090324，將之溶于適量蒸餾水中，定容為2 mg/mL 備用。E2免疫反應(yīng)試劑，購自上海藍怡科技有限公司;1640 培養(yǎng)液、四季青新生牛血清、Sucrose、DMSO、100 mm 培養(yǎng)皿、水合氯醛、多聚甲醛、玻璃毛細管、苦味酸等，均購自廣州威佳科技有限公司。AIA－1800 全自動免疫分析儀，日本東曹株式會社產(chǎn)品;Kryo320－1.7 程序降溫儀，英國Planer 公司產(chǎn)品;高精度加液器及吸頭(2～20 μL、20～200 μL、200～1000 μL)、－20 ℃低溫冰箱、冷凍離心機、4 ℃冰箱、液氮及液氮罐、凍存管、玻璃試管、EP 管、記號筆、水浴箱、眼科手術(shù)器械等，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)婦科實驗室提供。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

取Wistar 大鼠210 只，隨機分為自體移植模型組、自體移植+壽胎丸組、異體移植模型組、異體移植+壽胎丸組、異體移植+環(huán)孢A(CsA)組、異體移植+ CsA + 壽胎丸組和正常對照組7 組，每組30 只。除正常對照組僅行腹部切開縫合外，其余各組大鼠以100 g/L 水合氯醛進行腹腔注射麻醉，下腹部消毒，正中線切口，腹腔探查并摘除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎殘端，術(shù)后傷口涂紅霉素軟膏抗感染。術(shù)后第5 天起，每天行細胞學(xué)涂片，連續(xù)9 d，涂片顯示無周期性變化，提示去勢徹底。

取出大鼠卵巢后，立即置于4 ℃含體積分數(shù)10%胎牛血清的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，洗去血跡，用手術(shù)刀片將系膜去掉，冷凍保存。凍融方案采用Oktay 等1998 年提出的慢凍—快融經(jīng)典方案［1］。異體移植組:于偏離Wistar 大鼠原手術(shù)切口約0.5 cm 處縱行切開1 cm，將SD 大鼠的雙側(cè)卵巢分別移植于Wistar 大鼠切口兩側(cè)的腹壁上，縫合皮膚，傷口涂紅霉素軟膏抗感染［2］。自體移植組:采用快融法復(fù)蘇冷凍卵巢［1］后，參照異體移植組手術(shù)方案移植。自體移植+壽胎丸組和異體移植 + 壽胎丸組均給予壽胎丸26.8 g/(kg·d)，28 d;異體移植+ CsA 組，給予CsA 10 μg/(g·d)，連用14 d 后，6 μg/(g·d)再連用14 d;異體移植+ CsA + 壽胎丸組，給予CsA 6 μg/(g·d)和壽胎丸26.8 g/(g·d)，連用28 d;自體移植模型組、異體移植模型組和正常對照組均給予等量生理鹽水28 d。各組均灌胃給藥。移植術(shù)后24 h 第1 次給藥，以后每隔24 h 給藥1 次。

1.4 檢測指標

1.4.1 體質(zhì)量

移植術(shù)前1 日及移植術(shù)后第7，14，21，28，35 天時測量各組大鼠的體質(zhì)量并記錄。

1.4.2 動情情況

通過陰道細胞涂片檢測。移植術(shù)前了解去勢后的Wistar 鼠的去勢情況。去勢術(shù)后第5 天起，每天行細胞學(xué)涂片檢查，連續(xù)9 d。若涂片顯示無周期性變化，提示去勢徹底。移植術(shù)后第5 天開始行陰道細胞涂片，于10 ×10 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，取5 個不同視野，計算白細胞、有核細胞、角化細胞各占百分數(shù)。若滿視野均為角化細胞，則認為動物出現(xiàn)動情周期。

1.4.3 血清E2水平

移植術(shù)前1 日，自眼眶后靜脈叢取血檢測去勢后的血清E2水平。移植術(shù)后第6～15 天、第16～25 天以及第26～35 天，根據(jù)陰道涂片，選動情第1 天取血，以全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀自動完成全部檢測步驟。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標準差(s)表示，兩組組間比較采用t檢驗，多組比較根據(jù)設(shè)計不同分別采用單因素方差分析和析因設(shè)計的方差分析，多重比較用q檢驗。以P＜0.05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時點體質(zhì)量對比

在移植后14 d，自體移植模型組大鼠體質(zhì)量與異體移植模型組、異體移植+壽胎丸組、正常對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其余各組在各時點對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。自體移植壽胎丸組、異體移植模型組各有1 只大鼠因移植術(shù)前取血時麻醉過深致死，異體移植模型組另有1只大鼠因移植術(shù)后腸梗阻死亡，死亡大鼠未納入統(tǒng)計。見表1。

表1 各組大鼠不同時點體質(zhì)量對比 g，±s

表1 各組大鼠不同時點體質(zhì)量對比 g，±s

移植前1 d 移植前7 d 移植前移植前21 d 移植前28 d 移植前35 d分 組14 d動物數(shù)動物數(shù) 體質(zhì)量自體移植模型組 30 213.50±9.55 30 217.20±13.71 24 216.79±20.63 18 226.17±9.54 12 236.58±9.010 6 243.17±8.動物數(shù) 體質(zhì)量動物數(shù) 體質(zhì)量體質(zhì)量動物數(shù) 體質(zhì)量動物數(shù) 體質(zhì)量232自體移植壽胎丸組 29 211.20±11.70 29 219.47±14.78 24 223.88±15.19 18 227.94±13.53 12 245.17±11.595 6 245.17±12.624異體移植模型組 28 216.50±9.40 28 220.20±11.38 23 229.17±13.52* 18 231.78±13.06 12 242.33±15.899 6 247.00±14.227異體移植+壽胎丸組 30 213.43±9.79 30 217.87±10.76 24 229.83±12.40* 18 235.89±13.87 12 240.50±13.787 6 248.17±19.219異體移植+CsA 組 30 212.27±11.81 30 214.93±14.14 24 220.71±12.28 18 236.06±17.63 12 242.17±16.776 6 250.17±27.088異體移植+CsA+壽胎丸組 30 212.23±9.71 30 218.23±9.71 24 223.58±12.29 18 229.89±14.27 12 239.67±13.620 6 242.83±13.615正常對照組 30 209.17±10.48 30 220.57±9.67 24 228.63±9.97* 18 234.94±11.52 12 241.94±11.260 6 246.17±11.125

注:與自體移植模型組同期對比，*P＜0.05。

2.2 各組大鼠動情情況對比

自體移植模型組30 只大鼠中動情21 只，自體移植壽胎丸組29 只中動情22 只，異體移植模型組28 只中動情0 只;異體移植+壽胎丸組30 只中動情5 只，異體移植+CsA 組30 只中動情8 只，異體移植+CsA+壽胎丸組30 只中動情10 只，正常對照組30 只中動情30 只。

2.3 各組大鼠血清E2 水平對比

2.3.1 自體移植與異體移植模型大鼠不同時點E2水平對比

除移植前1d 這個時點外，其余3 個時點，異體移植模型組的E2水平均較自體移植模型組低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。自體移植模型組后2 個時點的E2水平、異體移植模型組后3 個時點的E2水平均較正常對照組低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示:異體卵巢移植后發(fā)生了嚴重的急性排斥反應(yīng)，自體卵巢移植過程中的凍融損傷、缺血缺氧損傷等因素也影響到移植卵巢的長期存活。見表2。

表2 自體移植與異體移植模型大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

表2 自體移植與異體移植模型大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

注:與自體移植模型組同期對比，* P＜0.05;與正常對照組同期對比，# P＜0.05。

分 組1d動物數(shù) E移植前2移植后第6～15天動物數(shù) E 2移植后第16～25天動物數(shù) E 2移植后第26～35天動物數(shù) E 2自體移植模型組 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27# 12 69.78 ±18.78#異體移植模型組 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72* # 18 29.47 ±15.96* # 12 32.26 ±11.39* #正常對照組 30 58.18 ±13.27 30 88.27 ±27.52 18 101.40 ±23.81 12 108.05 ±36.80

2.3.2 自體卵巢移植兩組大鼠不同時點E2水平對比

兩組各時點的E2水平對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示壽胎丸在提高自體移植卵巢成活率、促進內(nèi)分泌功能恢復(fù)等方面療效不明顯。見表3。

表3 自體移植模型組與自體移植+壽胎丸組大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

表3 自體移植模型組與自體移植+壽胎丸組大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

分 組1d動物數(shù) E移植前2移植后第6～15天動物數(shù) E 2移植后第16～25天動物數(shù) E 2移植后第26～35天動物數(shù) E 2自體移植模型組 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27 12 69.78 ±18.78自體移植+壽胎丸組 29 40.65 ±16.98 29 70.19 ±22.01 18 79.04 ±22.34 12 76.69 ±37.42

2.3.3 異體卵巢移植各組大鼠不同時點E2水平對比

對異體卵巢移植各組做單因素方差分析，移植前1 d，各組的E2水平對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);移植后第6～15 天、第16～25 天、第26～35 天，異體移植+CsA 組、異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植模型組和異體移植+壽胎丸組(P＜0.05);移植后第6～15 天、第26～35天，異體移植+CsA+壽胎丸組的E2水平高于異體移植+CsA 組(P＜0.05);異體移植+壽胎丸組的E2水平和異體移植模型組對比，在移植后各時點差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，在移植后第6～15 天、第16～25 天，CsA 的主效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示:CsA 可提高大鼠異體卵巢移植后的E2水平，壽胎丸與CsA 的交互作用是正向的。移植后第26～35 天，CsA 與壽胎丸的主效應(yīng)差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示:CsA 和壽胎丸均有抗移植排斥的作用，但單用壽胎丸，尚不能逆轉(zhuǎn)排斥。見表4。

表4 異體卵巢移植各組大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

表4 異體卵巢移植各組大鼠不同時點E2 水平對比 pmol·L －1，±s

分 組1d動物數(shù) E移植前2移植后第6～15 天#△動物數(shù) E 2移植后第16～25 天#動物數(shù) E 2移植后第26～35 天*#動物數(shù) E 2異體移植模型組 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72 18 29.47 ±15.96 12 32.26 ±11.39異體移植+壽胎丸組 30 44.84 ±20.75 30 25.99 ±14.81 18 31.20 ±10.20 12 40.86 ±18.52異體移植+CsA 組 30 47.47 ±15.75 30 67.89 ±28.44※◆ 18 80.35 ±25.95※◆ 12 72.73 ±23.08※◆異體移植+CsA+壽胎丸組 30 50.35 ±10.02 30 88.63 ±33.00※◆☆ 18 90.86 ±32.75※◆ 12 97.07 ±35.45※◆☆

3 討 論

3.1 壽胎丸的現(xiàn)代藥理研究

壽胎丸為補腎安胎之代表方。方中重用菟絲子為主藥，菟絲子性柔潤而多液，可平補腎陰腎陽。該藥補而不燥，滋而不膩，為安胎之首選藥物?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列其為上品，主治“續(xù)絕傷，補不足，益氣力，肥健人”。續(xù)斷補肝腎安胎，據(jù)藥理學(xué)研究，其有抗維生素E 缺乏癥的作用而利于孕卵發(fā)育。桑寄生補肝腎，兼養(yǎng)血安胎。阿膠能補血滋陰止血安胎。全方具有補腎氣、固沖任、調(diào)氣血、安胎的作用。臨床用于治療先兆流產(chǎn)、反復(fù)自然流產(chǎn)療效確切、顯著［3－6］。有研究證明，壽胎丸能促進小鼠幼鼠的子宮和卵巢發(fā)育，對正常和妊娠大鼠離體子宮平滑肌的收縮頻率和活動力有明顯抑制作用［7］。加味壽胎丸復(fù)方能提高妊娠期血清孕激素水平和子宮蛻膜孕激素受體(PR)的表達，改善患者外周血淋巴細胞亞群失衡，調(diào)節(jié)免疫功能，降低流產(chǎn)率［8］。

3.2 壽胎丸對自體卵巢移植大鼠E2 分泌的影響

移植術(shù)后E2的分泌變化說明將自體卵巢移植到大鼠腹膜后，短時間內(nèi)即可重建血液循環(huán)，移植的卵巢也能恢復(fù)內(nèi)分泌功能。有研究［9］發(fā)現(xiàn):皮下無血管移植，移植物血管重建在移植后的48 h 就開始了。本課題研究發(fā)現(xiàn):自體卵巢移植后第16～25 天、第26～35 天的E2分泌未繼續(xù)增多，僅維持在一個較高水平，較正常對照組低(P＜0.05)，提示移植卵巢過程中的凍融損傷、缺血缺氧損傷等因素，導(dǎo)致了大部分卵泡丟失，內(nèi)分泌功能相應(yīng)減退。有文獻［10］報道:卵巢組織在凍融過程中會損失7%的卵泡，但移植后組織的局部缺血性損傷會使移植物損失全部的生長卵泡群，以及顯著數(shù)量的原始卵泡，新血供重新建立前可能喪失60%以上的原始卵泡，認為卵巢移植后缺血損傷可能限制了自體移植卵巢長期存活。

自體卵巢移植后缺血缺氧損傷是導(dǎo)致卵泡丟失的最主要原因。壽胎丸可能因為不能加速自體卵巢移植后的血管重建，從而在提高自體移植卵巢成活率、促進內(nèi)分泌功能恢復(fù)等方面療效不明顯。

3.3 壽胎丸對異體卵巢移植大鼠E2 分泌的影響

唐麗麗等［2］研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸有助于異體卵巢移植術(shù)后卵巢的成活，促使移植卵巢恢復(fù)內(nèi)分泌功能。本課題研究發(fā)現(xiàn)，卵巢移植術(shù)后，異體移植+CsA 組、異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植模型組和異體移植+ 壽胎丸組(P＜0.05)，異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植+CsA 組(P＜0.05)，說明異體卵巢移植大鼠，應(yīng)用CsA 和壽胎丸抗排斥后，移植卵巢內(nèi)分泌功能恢復(fù);壽胎丸與CsA 有協(xié)同作用，二者聯(lián)合使用，可更好地逆轉(zhuǎn)移植后的急性排斥反應(yīng)，促進異體移植卵巢存活;單獨應(yīng)用壽胎丸的抗排斥效果并不理想。妊娠和器官移植部分相似的免疫機制，可能是壽胎丸抗移植排斥反應(yīng)起作用的基礎(chǔ)。

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