補腎健脾復方對流產(chǎn)大鼠蛻膜Fas/FasL表達干預的實驗研究*

劉明珠，許麗綿

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450052;2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510405)

自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見病之一，發(fā)病率有逐年增長趨勢，且多數(shù)為早期流產(chǎn)。自然流產(chǎn)的發(fā)病原因除了遺傳基因缺陷、內(nèi)分泌異常、全身性疾病、生殖器官異常、感染等方面外，隨著近代免疫學研究的進展，更多的醫(yī)學者把目光聚焦在免疫因素方面，通過對生殖道特別是子宮局部免疫狀況的研究，認識到母胎界面免疫微環(huán)境的改變對妊娠有巨大的影響，如母胎界面Fas/FasL表達的異常可以引起子宮局部免疫微環(huán)境的破壞使妊娠失敗而流產(chǎn)。本實驗以羥基脲和米非司酮建立腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型［1］，通過補腎健脾復方對腎虛黃體抑制流產(chǎn)模型大鼠子宮蛻膜組織Fas/FasL表達的干預，探討補腎健脾中藥在防治自然流產(chǎn)的過程中對子宮免疫微環(huán)境的影響，進而揭開中藥安胎的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級成熟SD大鼠，雌性64只，8～10周齡，體質(zhì)量250～300 g;雄性32只，10～12周齡，體質(zhì)量350～380 g。兩者均購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2003－0001，粵監(jiān)證字2006A014。

1.2 藥品、試劑與儀器

補腎健脾復方，由菟絲子、川續(xù)斷、桑寄生、黨參、北黃芪等8味藥組成，由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科制備提供。根據(jù)大鼠與人的藥量換算公式，按每只大鼠體質(zhì)量8 μL/(g·d)進行計算，濃縮后每只大鼠每天的中藥量相當于50 kg體質(zhì)量的人2劑/d的藥量。羥基脲，規(guī)格0.1 g/片，上海中西制藥有限公司產(chǎn)品，批號 H19990263;米非司酮，規(guī)格25 mg/片，上海醫(yī)藥有限公司華聯(lián)制藥廠產(chǎn)品，批號H10950202;黃體酮注射液，規(guī)格10 mg/1 mL/支，天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品，批號H12020534;Rabbit Anti－FAS( 批 號 BA0484)、Rabbit Anti－FASL(批號BA0049)，均購自武漢博士德生物工程公司;DAB顯色試劑盒(棕黃色，批號AR1022)、S－P免疫組化染色試劑盒(批號30577916)，均購自中山生物試劑有限公司。AXIOSTAR PLUS型光學顯微鏡，德國Zeiss公司產(chǎn)品;TP1020型徠卡生物組織自動脫水機、EG1140型徠卡石蠟包埋機、RM2050型徠卡石蠟切片機，德國Leica－徠卡產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將雌雄大鼠按2∶1比例合籠。每天觀察雌鼠陰道涂片。以陰道涂片出現(xiàn)精子計為妊娠第1天。將48只雌性大鼠隨機分為正常妊娠組、補腎健脾方組、黃體酮組、模型組4組，每組各12只。正常妊娠組從妊娠第1天起給予生理鹽水8 μL/(g·d)灌胃，連續(xù)11 d。除正常妊娠組外，其余大鼠均于妊娠第1到第10天灌服羥基脲(450 μg/g)，第11天灌服米非司酮(3.75 μg/g)，灌服米非司酮24 h后處死動物。在造模的同時，補腎健脾方組從妊娠第1天起給予補腎健脾方藥8 μL/(g·d)灌胃，連續(xù)10 d。黃體酮組從妊娠第1天起肌注黃體酮針8 μL/(g·d)，隔天1次，連續(xù) 10 d。模型組從妊娠第1天起生理鹽水8 μL/(g·d)灌胃，連續(xù)10 d。

1.4 檢測指標

檢測腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型子宮蛻膜組織的Fas和FasL表達。于大鼠妊娠第12天，解剖各組大鼠，使子宮離體，取蛻膜組織，用免疫組織化學S－P法檢測孕鼠子宮蛻膜組織Fas和FasL表達;并常規(guī)HE染色，用免疫組織化學S－P法檢測Fas和FasL表達。

1.4.1 免疫組織化學法操作步驟

①取實驗大鼠子宮的蛻膜組織放入100 g/L福爾馬林固定，常規(guī)包埋，石蠟切片，用防脫片劑處理過的載玻片撈取切片，經(jīng)純二甲苯脫臘2次，每次6 min;梯度乙醇脫二甲苯各2 min。自來水、PBS漂洗2 min×3次。加30 g/L H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;熱修復抗原，滴加50 g/L BSA封閉液，室溫20 min。滴加1∶150稀釋的一抗，Rabbit Anti－FAS、Rabbit Anti－FASL 抗體，37 ℃ 恒溫箱內(nèi)1 h;取1張切片用PBS液代替一抗作陰性對照。PBS沖洗，3 min×3次，滴加生物素化二抗、山羊抗兔IgG，37℃恒溫箱內(nèi)20 min。PBS(pH值 7.2～7.6)洗滌2 min×3次。

滴加試劑SABC，37℃恒溫箱內(nèi)20 min。PBS(pH值7.2～7.6)洗滌5 min×4次。PBS洗后加入DAB，顯色1～5 min。蘇木素淺復染，常規(guī)脫水、封片、分析結(jié)果。

1.4.2 結(jié)果判斷

HE染色結(jié)果:細胞核呈藍色，細胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色，鈣鹽和各種微生物染成藍色或藍紫色。結(jié)果的判定是光鏡下觀察各組胞漿或胞膜內(nèi)棕黃色顆粒為陽性標準，每張切片隨機取5個高倍視野。結(jié)果評定標準:與背景比，“－”為細胞內(nèi)無棕黃色陽性顆粒或呈與背景均勻一致的很淡黃色;“+”為細胞膜和細胞漿內(nèi)可見淡棕黃色顆粒;“++”為細胞膜和細胞漿內(nèi)可見清晰棕黃色顆粒;“+++”為細胞膜和細胞漿內(nèi)見深棕黃色顆粒。根據(jù)顯色強度分別計為0，1，2，3分;并計算陽性細胞數(shù)所占整個視野的百分比即陽性率，用%表示，染色強度指數(shù)(SⅡ)=陽性率×強度計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標準差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較用配對 t檢驗。以 P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

4組腎虛黃體抑制大鼠流產(chǎn)模型蛻膜組織細胞中均有Fas及FasL陽性表達，主要集中在細胞膜及細胞漿中。

2.1 各組大鼠蛻膜組織Fas表達染色強度指數(shù)對比

與正常妊娠組對比，模型組蛻膜組織細胞Fas表達的平均染色強度指數(shù)明顯增高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組對比，補腎健脾方組Fas表達平均染色強度指數(shù)減低(P＜0.01)，黃體酮組Fas表達平均染色強度指數(shù)減低(P＜0.05)。補腎健脾方組、黃體酮組和正常妊娠組對比，F(xiàn)as染色強度指數(shù)變化不明顯，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠蛻膜組織Fas表達染色強度指數(shù)對比±s

表1 各組大鼠蛻膜組織Fas表達染色強度指數(shù)對比±s

注:與模型組對比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與正常妊娠組對比，##P ＜0.01。

組動物數(shù) 平均染色強度指數(shù)正常妊娠組 10 0.38±0.06別*模型組 12 0.84±0.13##黃體酮組 12 0.41±0.07*補腎健脾方組 12 0.38±0.07＊＊

2.2 各組大鼠蛻膜組織FasL表達染色強度指數(shù)對比

與正常妊娠組對比，模型組子宮蛻膜組織細胞FasL的平均染色強度指數(shù)降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組對比，補腎健脾方組及黃體酮組FasL表達均增高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。補腎健脾方組、黃體酮組與正常妊娠組對比，F(xiàn)asL染色強度指數(shù)變化不明顯，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠蛻膜組織FasL表達染色強度指數(shù)對比±s

表2 各組大鼠蛻膜組織FasL表達染色強度指數(shù)對比±s

注:與模型組對比，* P＜0.05;與正常妊娠組對比，#P＜0.05。

組動物數(shù) 平均染色強度指數(shù)正常妊娠組 10 0.48±0.08別*模型組 12 0.27±0.03#黃體酮組 12 0.49±0.05*補腎健脾方組 12 0.45±0.06*

3 討論

Fas即Apo－1或CD95，是TNF/NGF受體家族Ⅰ型膜蛋白，F(xiàn)as配體FasL是Ⅱ型膜蛋白。Fas做為一種普通表達的受體分子，可出現(xiàn)在包括淋巴細胞的多種細胞表面，而FasL的表達卻通常只出現(xiàn)在活化的T細胞(特別是活化的CTL)和NK細胞上。已被活化的殺傷性免疫細胞往往能夠最有效地以凋亡途徑殺死靶細胞，但表達FasL的效應殺傷細胞會與自身表達的Fas結(jié)合，誘導自身的凋亡過程，此被稱為活化誘導的細胞凋亡(AICD)［2］。

多數(shù)研究［3－4］發(fā)現(xiàn):Fas/FasL在母胎免疫耐受中起重要作用，即表達FasL的絨毛滋養(yǎng)細胞能夠殺傷入侵到胎盤絨毛的Fas淋巴細胞，從而使滋養(yǎng)細胞免受母體免疫細胞的破壞。因此滋養(yǎng)細胞FasL表達異常或者淋巴細胞Fas表達異常都可能導致胎盤部位免疫耐受的破壞從而引起自然流產(chǎn)。

根據(jù)中醫(yī)“腎主生殖”“腎藏生殖之精”“又藏水谷之精氣”的理論，對臨床上免疫調(diào)節(jié)異常的流產(chǎn)，中醫(yī)辨證為脾腎虛弱、胎元不固，治療多采用補腎健脾的方藥。從組方上看，菟絲子性溫味甘，歸肝腎脾經(jīng)，平補腎陰腎陽，補而不燥，滋而不膩。黃芪性微溫味甘，歸脾肺經(jīng)，補氣健脾。兩藥一補腎，一健脾，先后天氣血雙補。桑寄生既可補肝腎養(yǎng)血，又能固沖任安胎。續(xù)斷補肝腎強筋骨，調(diào)沖任，止血安胎。黨參性平味甘，歸脾肺經(jīng)，助北芪補中益氣，生津養(yǎng)血。諸藥合用，具有補腎健脾、益氣養(yǎng)血、調(diào)沖安胎的作用。

本研究采用免疫組化方法對腎虛黃體抑制流產(chǎn)孕鼠和正常孕鼠的蛻膜組織表面Fas/FasL表達進行研究，均在蛻膜組織檢測到Fas和FasL的表達，并且腎虛黃體抑制流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織細胞FasL表達強度明顯低于正常孕鼠，F(xiàn)as表達明顯高于正常孕鼠。一方面，F(xiàn)asL表達的降低使受異體抗原刺激增生的Fas陽性T淋巴細胞凋亡數(shù)量減少，使流產(chǎn)蛻膜細胞Fas表達明顯增強;同時Fas表達增高又進一步消耗FasL，形成惡性循環(huán);此外，F(xiàn)asL表達降低又使Fas/FasL介導的AICD機制平衡失調(diào)，大量被激活的T淋巴細胞破壞了蛻膜表面的免疫赦免，免疫應答過強造成母胎界面免疫損傷，從而影響妊娠的繼續(xù)。本研究表明，補腎健脾復方、黃體酮可以增加腎虛黃體抑制流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織FasL表達強度、降低Fas表達強度，且補腎健脾復方的作用和黃體酮對比，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。由此推斷，補腎健脾中藥可能一方面通過增加FasL的表達，使受異體抗原刺激增生的Fas陽性T淋巴細胞及時凋亡，使滋養(yǎng)細胞免受淋巴細胞的攻擊;另一方面通過降低Fas表達，使Fas/FasL介導的AICD機制恢復平衡協(xié)調(diào)，從而起到安胎的作用。

［1］寧艷，羅頌平，梁國珍.補腎健脾中藥復方對腎虛黃體抑制妊娠大鼠流產(chǎn)模型的實驗研究［J］.中國醫(yī)藥學報，2000，15(6):428 －430.

［2］Medena JP，Scaffidi C，Kischkel ME，et al.FLICE is activated by association with the CD95 death－inducing signaling complex［J］.EMBO J，1997，16:2794.

［3］劉玉昆，張建平，鄺健全，等.Fas/FasL在復發(fā)性自然流產(chǎn)患者中的表達［J］.中山大學學報:醫(yī)學科學版，2004，25(6):581－585.

［4］Kauma SW，Huff TF，Hayes N.Placental Fas Ligand expression is a mechanism for meternal immune tolerance to the fetus［J］.J lin ndocrino Metab，1999，84(6):2188 －2194.