吡哌酸有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究*

顧 云，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

吡哌酸為廣譜合成藥物，可切斷DNA鏈，主要作用于細(xì)菌細(xì)胞的DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，干擾DNA的合成而使細(xì)菌死亡，對(duì)包括綠膿桿菌在內(nèi)的所有革蘭陰性桿菌均有效，并對(duì)部分革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌也有效。吡哌酸與抗生素之間沒有交叉耐藥性;而且與慶大霉素、羧芐青霉素有協(xié)同作用。為更好地控制質(zhì)量，本試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定吡哌酸有關(guān)物質(zhì)，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，方法簡(jiǎn)便，可作為吡哌酸的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

LC-2010 cLass-vp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，AG245型電子天平，PB-10型精密 pH計(jì)(塞多利斯公司)，恒溫干燥箱DN64(日本Uamato)，紫外線殺菌車DZS3型(上?？屏栳t(yī)療器械有限公司)。吡哌酸供試品(山東新華制藥股份有限公司提供，批號(hào)081195、081196、081197)，吡哌酸對(duì)照品(山東新華制藥股份有限公司提供，批號(hào)20080512)。乙腈、甲醇為色譜純，水為凈化水，枸櫞酸、癸烷磺酸鈉及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱：XDS-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：枸櫞酸癸烷磺酸鈉溶液(取枸櫞酸5.7 g、癸烷磺酸鈉1.7 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml)-乙腈 -甲醇(60∶20∶20);流速：1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μl，監(jiān)測(cè)器：紫外檢測(cè)器(UV)。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.3 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液適量，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 ml中含0.6 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取吡哌酸適量，加流動(dòng)相制成0.3 mg/ml的溶液，在紫外燈下(254 nm)光照2 h，混勻，作為系統(tǒng)適用性測(cè)試溶液。吡哌酸主峰的保留時(shí)間約為18 min，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B分別以相對(duì)保留時(shí)間約為0.8和1.2限定，兩降解雜質(zhì)含量分別約為0.3%和0.3%，與主峰的分離度分別不小于 5.0和 3.6，見圖1。

圖1 吡哌酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的HPLC色譜圖(XDB柱)

2.4 專屬性試驗(yàn) 經(jīng)以下條件破壞，試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)峰之間、雜質(zhì)與主峰之間均能分離良好，本方法專屬性好，色譜圖見圖2。

圖2 酸破壞產(chǎn)物(A)堿破壞產(chǎn)物(B)氧化破壞產(chǎn)物(C)熱破壞產(chǎn)物(D)光照破壞產(chǎn)物(E)溶液紫外光照破壞產(chǎn)物(F)HPLC色譜圖

2.4.1 酸破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加濃鹽酸1 ml，置100℃水浴中加熱

30 min后，加堿中和，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.4.2 堿破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加1 mol/L NaOH 溶液10 ml，置100℃水浴中加熱1 h后，加酸中和，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.4.3 氧化破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置 50 ml量瓶中，加 H2O2(30%)溶液 1 ml，室溫放置30 min后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.4.4 熱破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置50 ml量瓶中，置105℃干燥箱內(nèi)加熱2 h后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.4.5 光照破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置50 ml量瓶中，于強(qiáng)光下(4 000±500)Lx照射24 h后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.4.6 溶液紫外光照破壞試驗(yàn) 取吡哌酸(批號(hào)081195)15 mg，置50 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，于254 nm紫外光下照射2 h后，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法檢查。

2.5 最小檢出限 取吡哌酸適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并制成每1 ml含0.6 μg的溶液(相當(dāng)于供試品溶液的0.2%)，依次倍量稀釋，依法測(cè)定，結(jié)果對(duì)照溶液濃度為0.013 μg/ml時(shí)，峰高為基線噪音的3～4倍，故最低檢出濃度為0.013 μg/ml(相當(dāng)于供試品溶液的0.04%)。

2.6 供試品溶液穩(wěn)定性 供試品溶液(批號(hào)081195)，分別在1、2、4、6、18 和 24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為0.15%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.7 線性范圍 取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照溶液，分別精密量取0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ml，各置于100 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。依法測(cè)定，以峰面積與其濃度(μg/ml)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=198 466 X+540.43(r=1.000 0)。由此可見，吡哌酸濃度在 0.062 7 ～3.760 8 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 有關(guān)物質(zhì)的檢查 取“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液和對(duì)照溶液，精密量取對(duì)照溶液10 μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖見圖3。若顯示雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.2倍(0.2%)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積(1.0%)。三批樣品最大單一雜質(zhì)均為0.1%，雜質(zhì)總量均為0.2%。結(jié)果均符合規(guī)定。

圖3 吡哌有關(guān)物質(zhì)的供試品HPLC色譜圖

3 討論

3.1 相關(guān)性 本方法進(jìn)行了相關(guān)性考查試驗(yàn)，供試品溶液的濃度在0.1～0.5 m/ml范圍內(nèi)，溶液的濃度與有關(guān)物質(zhì)含量有良好的相關(guān)性。

3.2 粗放度 本方法采用不同型號(hào)色譜柱［XDBC18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、TSK ODS-80 S(150 mm ×4.6 mm，5 μm)、TC-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)］測(cè)定同批樣品(批號(hào)081195)有關(guān)物質(zhì)，測(cè)定結(jié)果基本一致，本方法耐用性良好，可以作為控制吡哌酸質(zhì)量的有效手段。

3.3 適用性試驗(yàn) EP 6.0/BP2008以對(duì)羥基苯甲酸乙酯與吡哌酸混合溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，要求兩者分離度應(yīng)不低于4.0，測(cè)試結(jié)果，兩者保留時(shí)間分別為11.1 和16.9 min，兩峰相距較遠(yuǎn)，分離度為10.8，且供試品在對(duì)羥基苯甲酸乙酯出峰處無雜質(zhì)。曾試驗(yàn)以對(duì)羥基苯甲酸乙酯和多種沙星類同系物作為分離度對(duì)照物峰，效果均不理想。本方法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，是經(jīng)不同條件的破壞實(shí)驗(yàn)，從中篩選出以紫外燈下(254 nm)光照2 h的供試品溶液作為分離度測(cè)試溶液。吡哌酸主峰的保留時(shí)間約18 min，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B分別以相對(duì)保留時(shí)間約為0.8和1.2限定，兩降解雜質(zhì)含量分別約為0.3%和0.3%，與主峰的分離度分別不小于 4.5 和3.5。

本方法采用高效液相色譜法取代以往薄層色譜法來測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，其結(jié)果可靠，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，此方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，可作為吡哌酸的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。