α－甘露糖苷酶研究進展＊

王姍姍，徐向軍，路 浩＊，趙寶玉＊，榮 杰，龐 龍，宋巖巖，張 樑，溫偉利

（1西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2內(nèi)蒙古阿左旗烏力吉動物衛(wèi)生監(jiān)督站，內(nèi)蒙古阿左旗 750322）

真核細胞中蛋白質(zhì)合成后需經(jīng)糖苷水解酶家族加工、修飾才能發(fā)揮生物活性，目前已知的糖苷水解酶家族超過100個［1－2］。α－甘露糖苷酶多為含38、47家族保守序列的糖苷水解酶，有文獻報道在糖苷水解酶92、99、125家族中也存在α－甘露糖苷酶。目前已測序的α－甘露糖苷酶基因序列超過2 000多種，主要存在于人、鼠、牛、禽類、昆蟲、細菌和植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、胞漿和其他細胞器中［3－5］。α－甘露糖苷酶主要參與蛋白質(zhì)糖基化和糖蛋白聚糖水解修飾。糖基化和糖蛋白聚糖水解與新生糖蛋白的折疊、成熟、分揀、運輸、構象維持、半衰期和生物活性關系密切，進而對細胞的黏附作用、炎癥反應、激素活性、關節(jié)炎、免疫監(jiān)視和癌細胞轉移等發(fā)揮作用［6］。

1 α－甘露糖苷酶的分類

α－甘露糖苷酶分類經(jīng)歷了3個階段，以酶發(fā)揮最佳活性的pH條件可分為酸性α－甘露糖苷酶、弱酸性α－甘露糖苷酶和中性α－甘露糖苷酶；以亞細胞器可分為細胞質(zhì)α－甘露糖苷酶、高爾基體α－甘露糖苷酶、溶酶體α－甘露糖苷酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α－甘露糖苷酶、細胞膜α－甘露糖苷酶等。目前普遍以基因保守序列進行分類，根據(jù)α－甘露糖苷酶的基因保守序列分為3類，即Ⅰ類α－甘露糖苷酶、Ⅱ類α－甘露糖苷酶和未分類α－甘露糖苷酶［7］。部分已知的α－甘露糖苷酶見表1。

1.1 Ⅰ類α－甘露糖苷酶

Ⅰ類α－甘露糖苷酶具有糖苷水解酶47家族保守序列［8］，分子質(zhì)量為63ku～73ku，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和部分細胞膜，主要是參與N－聚糖的分泌和蛋白監(jiān)控［9－11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ類α－甘露糖苷酶分為 MAN1A1／MAN1A3、MAN1B1、EDEM1、EDEM3等不同的亞型，主要作用于甘露糖α－1，2糖苷鍵或α－1，3糖苷鍵；高爾基體Ⅰ類α－甘露糖苷酶可分為 MAN1A、MAN1B／MAN1A2、MAN1C1、α－Man－Ⅰ等亞型，僅作用于甘露糖α－1，2糖苷鍵。

Ⅰ類α－甘露糖苷酶能將底物Man9GlcNAc2或Glc－Man9GlcNAc2水解成 Man8GlcNAc2，最終產(chǎn)物為Man6GlcNAc2或Man5GlcNAc2，其催化活性對鈣離子具有依賴性，能被基夫堿（kifunensine）和脫氧野尻霉素（deoxymannojirmycin，dMNJ）抑制，高爾基體Ⅰ類α－甘露糖苷酶還受DMM／KIF的抑制。Ⅰ類α－甘露糖苷酶一般不受苦馬豆素的抑制，或抑制作用較弱。

1.2 Ⅱ類α－甘露糖苷酶

Ⅱ類α－甘露糖苷酶具有糖苷水解酶38家族保守序列［12］，分子質(zhì)量為107ku～136ku，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、胞質(zhì)等，參與糖蛋白的合成和降解［13－15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅱ類α－甘露糖苷酶主要為alpha－Man－Ⅱ，alpha－Man－Ⅱ也同時存在于高爾基體中，作用于甘露糖α－1，3糖苷鍵或α－1，6糖苷鍵；高爾基體Ⅱ類α－甘露糖苷 酶 包 括 GMⅡ、MAN2A1、alpha－Man－Ⅱb、Manea、MAN2A2等，特異性作用于甘露糖α－1，3、α－1，6糖苷鍵；溶酶體Ⅱ類α－甘露糖苷酶包括 MAN2B1、MAN2B2兩種，特異性作用于甘露糖α－1，2、α－1，3、α－1，6糖苷鍵；胞質(zhì)Ⅱ類α－甘露糖苷酶主要為Man2c1，能特異性作用于甘露糖α－1，2、α－1，3、α－1，6糖苷鍵。

Ⅱ類α－甘露糖苷酶底物為 Man5GlcNAc2、GlcNAMan5GlcNAc2，部 分 作 用 于 Man3GlcNAc2，但 對Man3GlcNAc無催化作用。Ⅱ類α－甘露糖苷酶催化活性依賴于鋅離子，部分對鈷離子具有依賴性，而銅離子能抑制某些Ⅱ類α－甘露糖苷酶的活性。Ⅱ類α－甘露糖苷酶活性受苦馬豆素（swainsonine，SW）抑制，但抑制程度不同，其部分受dMNJ抑制。

1.3 未分類α－甘露糖苷酶

近年來，人們發(fā)現(xiàn)α－甘露糖苷酶不僅存在于糖苷水解酶38、47家族中，糖苷水解酶92、99、125家族中也存在α－甘露糖苷酶，這些新發(fā)現(xiàn)的α－甘露糖苷酶作用基本與Ⅰ類或Ⅱ類α－甘露糖苷酶作用相同，主要是催化低聚糖反應。含糖苷水解酶92家族保守序列的α－甘露糖苷酶，發(fā)現(xiàn)于棒狀桿菌（Microbacteriumsp.M－90）和多形桿菌（Bacteroidesthetaiotaomicron），對甘露糖α－1，2、1，3、1，4、1，6糖苷鍵具有水解作用，且酶催化活性對鈣離子具有依賴性［17］。含糖苷水解酶99家族保守序列的α－甘露糖苷酶發(fā)現(xiàn)亞馬遜斯瓦尼菌（Shewanellaamazonensis），能水解 GlcMan9GlcNAc2－PA，Glc3Man9GlcNAc2－PA，主要作用于α－1，2糖苷鍵［17］。含糖苷水解酶125家族保守序列的α－甘露糖苷酶發(fā)現(xiàn)于肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens），特異性作用于甘露糖α－1，6糖苷鍵，且對金屬離子無依賴性［1］（表1）。

表1 部分已知的α－甘露糖苷酶Table 1Partial knownα－mannosidase

續(xù)表1

2 α－甘露糖苷酶在糖基化過程中的作用

N－糖基化是在糖基轉移酶催化作用下，內(nèi)分泌蛋白和膜結合蛋白結合寡糖的過程，起始階段依賴于兩個條件，即粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體合成蛋白肽鏈和糖基化位點的形成。當肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔膜上的加工酶對N－糖鏈進行修剪、加工形成高甘露糖型，再經(jīng)高爾基體膜結構上的酶加工。α－甘露糖苷酶主要負責N－糖基化過程中糖蛋白糖鏈上不同類型甘露糖的修剪、加工，它既是N－聚糖成熟的必要酶，同時也參與N－聚糖的降解［18］。

2.1 α－甘露糖苷酶在成熟階段的作用

N－聚糖成熟過程中的寡聚糖前體為GLc3Man9GlcNAc2，其遠端3個葡萄糖基首先被葡萄糖苷酶特異性切除，生成 Man9GlcNAc2然后經(jīng)Ⅰ類α－甘露糖苷酶水解去掉4個甘露糖形成Man5GLcNAc2。Man5GLcNAc2又被N－乙酰葡糖胺轉移酶Ⅰ修飾，連接一個N－乙酰葡萄糖形成GLcMan5GlcNAc2，被運輸?shù)礁郀柣w腔面，經(jīng)Ⅱ類α－甘露糖苷酶剪切，去掉兩個甘露糖形成GLcMan3GlcNAc2，再由糖?；D移酶把單糖轉運至該寡聚糖分支糖鏈末端，N－聚糖加工完成，加工完成的N－聚糖再被轉運到特定組織及器官發(fā)揮生理功能［19］（圖1）。

圖1 N－聚糖加工過程Fig.1The N－linked glycosylation process

2.2 α－甘露糖苷酶在降解階段的作用

當?shù)鞍踪|(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生折疊錯誤、變異以及加工、修飾異常時，就會被選擇性的降解［20－21］。糖蛋白降解主要是在溶酶體中完成，異常糖蛋白被轉運到溶酶體內(nèi)后，經(jīng)一系列水解酶進行分解，也有部分經(jīng)過細胞質(zhì)途徑進行降解［22］。溶酶體α－甘露糖苷酶作用于 Man5GLcNAc2上的甘露糖α－1，3和α－1，6糖苷鏈，對甘露糖苷殘基進行剪切，產(chǎn)物再被糖基化或作為合成寡糖的供體。

3 α－甘露糖苷酶活性抑制的相關疾病

α－甘露糖苷酶代謝異?？梢鸲喾N疾病，目前較為常見的由α－甘露糖苷酶功能障礙引起的疾病有兩種，即α－甘露糖苷貯積癥（α－mannosidosis）和先天性紅細胞生成異常性貧血Ⅱ型（congenital dyserythropoietic anemia typeⅡ，HEMPAS）。

3.1 α－甘露糖苷貯積癥

α－甘露糖苷貯積癥是由于溶酶體α－甘露糖苷酶－MAN2B1功能異常引起的［23］。當 MAN2B1出現(xiàn)異常時，低聚糖代謝出現(xiàn)功能紊亂，糖蛋白水解無法進行，導致低聚糖蓄積于溶酶體中，病理組織學變化主要表現(xiàn)為細胞出現(xiàn)廣泛空泡變性，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)、骨骼發(fā)育不全，面部粗糙、聽力障礙、反復感染、肝脾腫大等癥狀。若患先天性溶酶體α－甘露糖苷酶功能障礙，會引起嬰兒踝骨畸形、發(fā)育遲緩、運動失調(diào)、智力障礙，甚至死亡，一般無法治愈［24］。

3.2 先天性紅細胞生成異常性貧血Ⅱ型

先天性紅細胞生成異常性貧血屬遺傳性紅細胞系無效造血家族性疾病，其臨床特點為慢性、難治性、輕或重度貧血，伴持續(xù)或間斷性黃疸，骨髓表現(xiàn)為紅細胞系無效造血、多核、核碎裂和形態(tài)異常，主要采取支持療法治療。根據(jù)血細胞骨髓形態(tài)和血清學檢查，先天性紅細胞生成異常性貧血又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅱ型是一種常染色體隱性遺傳疾病，因高爾基體α－甘露糖苷酶功能紊亂導致N－糖蛋白成熟過程發(fā)生異常，引起以紅細胞生成障礙、骨髓紅細胞多形核、紅細胞膜異常、溶血為特征的疾?。?5］。一般多發(fā)生于幼兒，表現(xiàn)為正細胞性貧血、黃疸、肝脾腫大，成熟紅細胞出現(xiàn)PNH紅細胞樣改變。

4 結語

甘露糖酶在機體低聚糖代謝中起著重要的作用，代謝異常時則會導致嚴重疾病，近年關于通過調(diào)節(jié)α－甘露糖苷酶實現(xiàn)腫瘤治療也有文獻報道，這為人類戰(zhàn)勝腫瘤提供新的研究方向。隨著苦馬豆素對α－甘露糖苷酶抑制作用的發(fā)現(xiàn)，研究人員先后利用苦馬豆素成功誘導了牛和小鼠α－甘露糖苷貯積癥模型，從而為進一步探索α－甘露糖苷貯積癥的機制和治療方法提供了新途徑。

［1］Gregg K J，Zandberg W F，Hehemann J H，et al.Analysis of a new family of widely distributed metal－independent｛alpha｝－mannosidases provides unique insight into the processing of N－linked glycans［J］.J Biol Chem，2011，286（17）：15586－15596.

［2］Wikipedia.2011.List of glycoside hydrolase families.http：／／en.wikipedia.org／wiki／List＿of＿glycoside＿hydrolase＿families［2011－04－10］.

［3］Shashidhara K S，Gaikwad S M.Class II alpha－mannosidase fromAspergillusfischeri：Energetics of catalysis and inhibition［J］.Int J Biol Macromol，2009，44（1）：112－115.

［4］Dohi K，Isoyama－Tanaka J，Misaki R，et al.Jack bean alphamannosidase digestion profile of hybrid－type N－glycans：Effect of reaction pH on substrate preference［J］.Biochimie，2011，93（4）：76－771.

［5］Intra J，De Caro D，Perotti M E，et al.Glycosidases in the plasma membrane of Ceratitis capitata spermatozoa［J］.Insect Biochem Mol Biol，2011，41（2）：90－100.

［6］Moremen K W.Golgi alpha－mannosidaseⅡ deficiency in vertebrate systems：implications for asparagine－linked oligosaccharide processing in mammals［J］.Biochem Biophys Acta，2002，1573（3）：225－235.

［7］劉紅霞，蘇衛(wèi)，張連峰.α－甘露糖苷酶研究進展［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16（11）：697－720.

［8］Liebmingera E，Hüttnera S，Vavraa U，et al.Class Iα－mannosidases are required for N－glycan processing and root development in arabidopsis thaliana［J］.The Plant Cell，2009，21：3850－3867.

［9］Zhou J，Lin C Z，Zheng X Z，et al.Functional analysis of an alpha－1，2－mannosidase from magnaporthe oryzae［J］.Current Genetics，2009，55（4）：485－496.

［10］Hosokawa N，Tremblay L O，Sleno B，et al.EDEM1accelerates the trimming of alpha 1，2－linked mannose on the C branch of N－glycans［J］.Glycobiology，2010，20（5）：567－575.

［11］Mora－Montes H M，Robledo－Ortiz C I，Gonzalez－Sanchez L C，et al.Purification and biochemical characterisation of endoplasmic reticulum alpha 1，2－mannosidase fromSporothrix schenckii［J］.Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz，2010，105（1）：79－85.

［12］Cobucci－Ponzano B，Conte F，Strazzulli A，et al.The molecular characterization of a novel GH38alpha－mannosidase from the crenarchaeonSulfolobussolfataricusrevealed its ability in de－mannosylating glycoproteins［J］.Biochimie，2010，92（12）：1895－1907.

［13］Hossain M A，Nakano R，Nakamura K，et al.Molecular characterization of plant acidic alpha－mannosidase，a member of glycosylhydrolase family 38，involved in the turnover of N－glycans during tomato fruit ripening［J］.J Biochem，2010，148（5）：603－616.

［14］Shashidhara，K S，Gaikwad S M.Conformational and functional transitions in class II alpha－mannosidase fromAspergillusfischeri［J］.J Fluorescence，2010，20（4）：827－836.

［15］Uno Y，Hashidume S，Kurita O，et al.DioscoreaoppositaThunb.alpha－mannosidase belongs to the glycosyl hydrolase family 38［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2010，32（4）：713－718.

［16］Zhu Y P，Suits M D L，Thompson A J，et al.Mechanistic insights into a Ca2＋－dependent family ofα－mannosidases in a human gut symbiont［J］.Nat Chem Biol，2010，6（2）：125－132.

［17］Matsuda K，Kurakata Y，Miyazaki T，et al.Heterologous expression，purification，and characterization of an alphamannosidase belonging to glycoside hydrolase family 99of shewanella amazonensis［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75（4）：797－799.

［18］Zeng Y C，Pan Y T，Asano N，et al.Homonojirimycin and N－methyl－h(huán)omonojirimycin inhibit N－linked oligosaccharide processing［J］.Glycobiology，1997，7（2）：297－304.

［19］Daniel P F，Winchester B，Warren C D.Mammalian alphamannosidases－－multiple forms but a common purpose？［J］.Glycobiology，1994，4（5）：551－566.

［20］Kukuruzinska M A，Lennon K.Protein N－glycosylation：molecular genetics and functional significance［J］.Crit Rev O－ral Biol Med，1998，9（4）：415－418.

［21］Schroder S，Matthes F，Hyden P，et al.Site－specific analysis of N－linked oligosaccharides of recombinant lysosomal arylsulfatase A produced in different cell lines［J］.Glycobiology，2010，20（2）：248－259.

［22］Bernon C，Carre Y，Kuokkanen E，et al.Overexpression of Man2C1leads to protein underglycosylation and upregulation of endoplasmic reticulum－associated degradation pathway［J］.Glycobiology，2011，21（3）：363－375.

［23］Damme M，Morelle W，Schmidt B，et al.Impaired lysosomal trimming of N－linked oligosaccharides leads to hyperglycosylation of native lysosomal proteins in mice with alpha－mannosidosis［J］.Mol Cell Biol，2010，30（1）：273－283.

［24］Malm D，Nilssen O.Alpha－mannosidosis［J］.Orphanet J Rare Diseases，2008，3（1）：doi：10.1186／1750－1172－3－21.

［25］Bianchi P，F(xiàn)ermo E，Vercellati C，et al.Congenital dyserythropoietic anemia type II（CDAII）is caused by mutations in the SEC23Bgene［J］.Hum Mutat，2009，30（9）：1292－1298.