田七總皂苷的制備及其免疫活性試驗(yàn)＊

謝麗麗，胡庭俊，潘貴珍，蘇子杰

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

田七（Panaxnotoginseng（Burk）FH Chen））又名三七、金不換、田七參、人參田七等［1］，屬五加科人參屬植物，主產(chǎn)于云南、廣西及四川等地，是我國(guó)的傳統(tǒng)珍貴藥材。田七含有皂苷、倍半萜、脂肪酸、酯類、苯取代物、烷烴等多種有效成分［2］，其中皂苷是田七的主要有效成分，總皂苷含量為12%［3］。田七除了具有傳統(tǒng)的止血補(bǔ)血、消腫止痛，雙向調(diào)節(jié)血糖、血脂的功效外，還有抗血栓、抗炎、抗腫瘤等作用［4］，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。田七主要活性成田七總皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）近年來國(guó)內(nèi)外有不少研究報(bào)道田七總皂苷具有改善心肌缺血、抗心律失常、降血脂、降血壓、降血糖、抗纖維化、抗氧化、改善微循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛等功效作用［5－7］，但其對(duì)免疫功能影響研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)從田七中分離純化出田七總皂苷，進(jìn)行薄層色譜鑒定及含量測(cè)定，觀察田七總皂苷對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只昆明系健康小鼠，雌雄各半，平均體重為18g～22g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要藥物與試劑 田七（60頭）購(gòu)于廣西南寧湘鄉(xiāng)大藥房（原產(chǎn)地：云南）。D101型大孔吸附樹脂，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)。人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。薄層板H，青島海洋化工廠生產(chǎn)（規(guī)格：10cm×10cm×5cm），批號(hào)20110608。注射用環(huán)磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)（批號(hào)，10082521）。小鼠IL－2、IFN－γ和TNF－αELISA試劑盒，均購(gòu)自南寧博仁生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 田七總皂苷制備

1.2.1.1 700mL／L乙醇回流提取 取100g田七粉末裝入圓底燒瓶中，加700mL／L乙醇1 000mL，浸泡0.5h，90℃水浴回流2h。收集濾液，再加700mL／L乙醇800mL，回流1.5h。收集濾液，并將兩次濾液合并。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，將剩余的少量液體于蒸發(fā)皿揮發(fā)至膏狀，然后冷凍干燥得皂苷粗提物。

1.2.1.2 大孔樹脂分離純化 稱取預(yù)處理好的D101型大孔樹脂10g（干重），濕法裝柱，藥液（濃度6.5mg／mL）以2mL／min流速通過樹脂柱，收集流出液，直至達(dá)到吸附平衡。用50g／L香草醛－冰醋酸判定平衡終點(diǎn)。水洗，以Molish反應(yīng)判定水洗終

點(diǎn)。然后用800mL／L乙醇以2mL／min進(jìn)行洗脫，收集流出液，用50g／L香草醛－冰醋酸判定洗脫終點(diǎn)。回收洗脫液中乙醇，剩余少量濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到較純田七總皂苷。

1.2.2.1 硅膠板活化 使用前將購(gòu)買的硅膠H板放置105℃活化30min以上。

1.2.2.2 供試品制備 取待檢樣品粉末10mg，加甲醇1mL使溶解完全，作為供試品。

1.2.2.3 對(duì)照品制備 另取人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg 1及三七皂苷R1，加甲醇制成每1mL各含0.5mg的混合液，作為對(duì)照溶液。

1.2.2.4 點(diǎn)樣及展開 吸取上述兩種溶液各0.8μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。

1.2.2.5 顯色 均勻噴以硫酸溶液（100mL／L濃硫酸），在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。觀察供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上，是否有對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，置紫外光燈（365nm）下檢視，是否顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.2.3紫外分光光度法測(cè)總皂苷含量

本研究所有的研究對(duì)象均為2016年到2018年我院血透中心的所有醫(yī)護(hù)人員,共計(jì)選擇15名護(hù)理人員進(jìn)行分層管理,根據(jù)《護(hù)士崗位管理實(shí)施方案》的相關(guān)規(guī)定,并且根據(jù)我科的實(shí)際情況對(duì)于血液透析室的護(hù)理人員崗位管理制度進(jìn)行制定,通過合理的方案進(jìn)行落實(shí),對(duì)于各個(gè)層級(jí)護(hù)理人員崗位職責(zé)和工作要求進(jìn)行落實(shí)。

1.2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取田七皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品2.9mg，加甲醇定容至25mL。即為每毫升含0.116mg田七皂苷Rg1的對(duì)照品溶液。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL對(duì)照品溶液，分別置于10mL具塞試管中，揮干溶劑。加現(xiàn)配50g／L 香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，60℃水浴15min，立即置冰水中冷卻至室溫。加冰醋酸5mL，混勻，放置15min，相應(yīng)試劑作空白對(duì)照。560nm測(cè)定吸光度OD［9］，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)（X），對(duì)應(yīng)具塞試管總皂苷的含量（mg）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 供試品測(cè)定 取供試品溶液0.5mL，水浴揮干，顯色，在560nm處測(cè)其吸光度值，并根據(jù)回歸方程計(jì)算出田七總皂苷的含量。每個(gè)供試品作3個(gè)重復(fù)，取其平均值。

1.2.4 田七總皂苷對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用

1.2.4.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 60只小鼠隨機(jī)分為6組，即Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組，每組10只，雌雄各半，試驗(yàn)前適應(yīng)3d。Ⅰ組為空白對(duì)照組，每只每天上午腹腔注射0.5mL生理鹽水，下午注射0.3mL生理鹽水；Ⅱ組為環(huán)磷酰胺（Cyclophospamide，CTX）組，上午腹腔注射0.5mL生理鹽水，下午腹腔注射CTX 30mg／kg；Ⅲ組～Ⅵ組為藥物處理組，上午分別腹腔給藥5、25、50、75mg／kg PNS，下午腹腔給藥30mg／kg CTX。持續(xù)給藥7d。

1.2.4.2 測(cè)定方法與組織學(xué)觀察 末次給藥后次日，將全部小鼠稱重，眼球采血，斷頸椎處死，取其胸腺、脾臟稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。將胸腺、脾臟浸泡在100mL／L甲醛水溶液中固定7d，做組織切片，HE染色，顯微鏡下觀察胸腺和脾臟的組織學(xué)變化。從眼球采血得到的血液中分離血清，用ELISA試劑盒按照說明檢測(cè)血清中IL－2、IFN－γ和TNF－α的水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別結(jié)果

圖1A、1B分別為日光下、紫外光下色譜圖。觀察可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜3個(gè)相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。表明供試品中含有人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1。

2.2 田七總皂苷含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。以人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，得到回歸方程：y＝0.150 1x＋0.013 6（R2＝0.996 4），表明在0.009 7mg／mL～0.048 3mg／mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 總皂苷含量 700mL／L乙醇回流提取得總皂苷含量為38.30%，經(jīng)大孔吸附樹脂純化后總皂苷純度明顯提高，總皂苷含量為70.52%。

2.3 對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.3.1 田七總皂苷對(duì)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

由表1可見，Ⅱ組（環(huán)磷酰胺模型組）與Ⅰ組比較，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有明顯下降，分別為極顯著（P＜0.01）和顯著差異（P＜0.05）；Ⅲ組～Ⅵ組（藥物處理組）與Ⅱ組相比，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均無顯著升高。另外，Ⅲ組、Ⅳ組的脾臟指數(shù)與Ⅰ組也無顯著差異。

2.3.2 田七總皂苷對(duì)血清中細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)作用 通過ELISA試劑盒檢測(cè)，3種細(xì)胞因子水平變化結(jié)果見表2。Ⅱ組血清中IL－2、IFN－γ及TNF－α水平相比Ⅰ組都有所下降，其中IFN－γ水平顯著下降（P＜0.05）。Ⅲ組～Ⅵ組給予田七總皂苷處理后，IL－2水平呈現(xiàn)隨給藥劑量增加而升高的趨勢(shì)，但與Ⅱ組相比各組均無顯著差異；IFN－γ水平呈現(xiàn)出先升高后降低，與Ⅱ組比較，Ⅳ組有顯著升高（P＜0.05）；TNF－α水平類似IFN－γ水平的變化趨勢(shì)，先升高后降低，與Ⅱ組比較，Ⅳ組、Ⅴ組TNF－α水平顯著升高（P＜0.05）。

圖1 田七總皂苷的薄層鑒別Fig.1TLC identification of Panax notoginsengsaponins

圖2 田七總皂苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2Standard curve of PNS purity

2.3.3 組織學(xué)變化

2.3.3.1 胸腺 在顯微鏡下可見，Ⅰ組小鼠胸腺分葉明顯，皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)厚而淋巴細(xì)胞密度高（圖3A）；Ⅱ組小鼠胸腺有非常明顯的萎縮，其皮質(zhì)髓質(zhì)分界較模糊，皮質(zhì)明顯變薄，細(xì)胞稀疏（圖3B）；Ⅲ組、Ⅳ組兩個(gè)低劑量組與模型組（Ⅱ組）相比，皮質(zhì)有所增厚，細(xì)胞密度也有所增加（圖3C、圖3D）；Ⅴ組、Ⅵ組高劑量組與模型組相比，皮質(zhì)增厚明顯，細(xì)胞密度增加也更明顯（圖3E、圖3F）。

2.3.3.2 脾臟 在顯微鏡下觀察脾臟可見，Ⅰ組小鼠脾臟紅髓與白髓分界清楚，脾小結(jié)大，而且淋巴細(xì)胞密集（圖4A）；Ⅱ組即模型組，其脾臟紅、白髓分界相對(duì)模糊，脾小結(jié)有明顯的縮小，淋巴細(xì)胞密度下降（圖4B）；Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組4個(gè)田七總皂苷藥物處理組與模型組相比，脾小結(jié)都有不同程度的增大，且脾小結(jié)數(shù)量也有所增多，淋巴細(xì)胞密度也有比較明顯的增加（圖4C、圖4D、圖4E、圖4F）。

表1 田七總皂苷（PNS）對(duì)胸腺和脾臟指數(shù)的影響Table 1Effect of Panax notoginsengsaponins（PNS）on the thymus and spleen indices

表2 田七總皂苷（PNS）對(duì)血清中IL－2、IFN－γ及TNF－α水平的影響Table 2Effects of Panax notoginsengsaponins（PNS）on IL－2，IFN－γand TNF－αlevels in serum of mice

圖3 小鼠胸腺組織學(xué)變化Fig.3The histological changes in thymus of mice

3 討論

3.1 田七總皂苷的制備和鑒別

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的乙醇回流法提取田七總皂苷，根據(jù)藥典對(duì)注射劑制備的要求，用新興并已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用的大孔吸附樹脂技術(shù)分離純化皂苷。因影響大孔吸附樹脂吸附與洗脫的因素繁多，本試驗(yàn)僅考慮了其中幾個(gè)主要因素，純化的最佳條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。皂苷成分是田七的主要有效成分，迄今為止，已經(jīng)從田七的不同部位分離出二三十種單體皂苷成分，其中有很多與同屬植物人參相同，其中以人參皂苷Rg1（40%）和 Rb1（35%）含量最高，還含有三七皂苷R1（15%）、R2、R3等田七特有的成分［10－11］。進(jìn)行薄層色譜鑒別可知，本試驗(yàn)分離純化得到的田七總皂苷中含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的3種主要成分，并測(cè)得總皂苷含量達(dá)70.52%。

3.2 免疫調(diào)節(jié)作用

3.2.1 建立免疫抑制模型 環(huán)磷酰胺是臨床上常用的細(xì)胞毒性化療藥物，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可損傷機(jī)體的免疫器官，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，造成免疫功能的低下［12］。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以30mg／kg劑量環(huán)磷酰胺腹腔注射給藥小鼠，持續(xù)給藥7d，胸腺、脾臟萎縮明顯，成功建立了小鼠免疫抑模型。

圖4 小鼠脾臟組織學(xué)變化Fig.4The histological changes in spleen of mice

3.2.2 免疫器官指數(shù)與組織形態(tài)學(xué)影響 胸腺和脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官。已有研究報(bào)道，免疫器官指數(shù)能較好的反應(yīng)機(jī)體免疫器官的重量變化，并且能將個(gè)體差異的影響最小化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，田七總皂苷能在一定程度上改善免疫抑制劑造成的胸腺和脾臟萎縮，但沒有顯著影響?？梢奝NS對(duì)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的恢復(fù)沒有明顯的促進(jìn)作用。

觀察動(dòng)物免疫器官的變化常選胸腺、脾臟，并且著重觀察胸腺皮質(zhì)厚度，脾臟脾小結(jié)的大小。胸腺皮質(zhì)增厚、脾小結(jié)增大、胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，提示機(jī)體免疫功能的提高［13］。用環(huán)磷酰胺造模的小鼠胸腺、脾臟萎縮非常明顯，皮質(zhì)、髓質(zhì)分界模糊，脾小結(jié)縮小、胸腺皮質(zhì)及脾淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。本研究用田七總皂苷處理后，隨著劑量的增加，能逐步改善受損胸腺和脾臟的組織結(jié)構(gòu)，尤其是50mg／kg、75mg／kg兩個(gè)劑量組，恢復(fù)胸腺和脾臟組織結(jié)構(gòu)的效果更明顯。結(jié)果提示PNS對(duì)機(jī)體的主要免疫器官胸腺、脾臟有較好改善和刺激作用，至少在一定程度上說明PNS能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

3.2.3 細(xì)胞因子水平變化 Th1細(xì)胞主要分泌IL－2和IFN－γ等［14］。IL－2是 T 細(xì)胞增殖、分化必不可少的細(xì)胞因子。IL－2還能促進(jìn)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，是最為重要的免疫調(diào)節(jié)因子之一。本試驗(yàn)中田七總皂苷處理組均能一定程度升高血清中IL－2水平，但差異不顯著。IFN－γ又稱Ⅱ型干擾素，主要來源于被激活的淋巴細(xì)胞。它能激活巨噬細(xì)胞，影響Th1／Th2平衡以及調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞，因此對(duì)固有免疫應(yīng)答、適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答均有重要的影響。25mg／kg劑量組能顯著升高血清中IFN－γ水平。腫瘤壞死因子是巨噬細(xì)胞被脂多糖（或干擾素）刺激后所產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，有α和β兩種。低濃度下，TNF－α能增強(qiáng)ICAM－1等黏附分子的表達(dá)；高濃度時(shí)會(huì)造成宿主嚴(yán)重的病理損傷［14］。此外，腫瘤壞死因子還能作用于Th細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的活化與擴(kuò)增。本試驗(yàn)結(jié)果提示，25mg／kg和50mg／kg劑量組能顯著升高血清中TNF－α水平?？偟脕碚f，田七總皂苷處理組能不同程度地影響小鼠血清中IL－2、IFN－γ及TNF－α的水平，從而通過細(xì)胞因子水平的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。

綜合免疫器官指數(shù)和組織形態(tài)影響以及血清中細(xì)胞因子的水平變化，說明田七總皂苷能在一定程度上增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能，這與周小玲［15］、孫云［16］、趙鵬等［17］研究結(jié)果相一致。

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