高效液相色譜法測(cè)定支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒中蒙花苷的含量

吳文飛，張利斌，李玉平(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院藥劑科，上海200433)

支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒系本院傳統(tǒng)中藥制劑，批準(zhǔn)文號(hào)為滬藥制字Z04180751，由羊乳根、小薊、桑白皮、側(cè)柏葉、麥冬等十一味藥材提取配制而成，具有消炎、化痰、止血的功效，能有效治療支氣管擴(kuò)張和感染所引起的咳嗽、痰多、咯血。本品在肺科醫(yī)院治療呼吸道疾病方面起著了重要作用，其生產(chǎn)和使用數(shù)量逐年遞增。本制劑活性成分中含有黃酮，對(duì)此，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，可以用高效液相色譜法測(cè)定出所含抗炎抗菌成分蒙花苷。本法可作為制劑質(zhì)量監(jiān)控項(xiàng)目之一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)HP 1100型高效液相色譜儀，包括手動(dòng)進(jìn)樣器，單元泵，紫外檢測(cè)器;N2000色譜工作站(浙江大學(xué));色譜柱為 DIKMA Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);BS 210S電子天平(德國(guó)賽多利斯)。

1.2 試藥 蒙花苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111528-200606);羊乳根、小薊等藥材(安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司);支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒(委托上海練塘藥業(yè)有限公司配制)，甲醇為色譜純;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:DIKMA platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);定量環(huán):20 μl;流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸(55∶44∶2);流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):326 nm;柱溫:室溫。理論板數(shù)按蒙花苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500［1］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蒙花苷對(duì)照品10.0 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋定容，按含量以98.3%計(jì)，得98.3 μg/ml的蒙花苷對(duì)照品貯備液，密封，2～8℃冰箱貯存。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒10 g，置索氏提取器中，用石油醚(60～90℃)100 ml回流2 h，棄去醚液，殘留物置40℃恒溫箱中過夜以揮干，再置索氏提取器中用甲醇100 ml回流提取4 h，放冷，提取液過濾，置100 ml量瓶中，用少量甲醇蕩洗燒瓶壁數(shù)次，洗液濾至上述量瓶中，定容，即得供試品原液。

2.2.3 陰性對(duì)照液 按處方制備不含小薊藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照液原液。

2.3 方法專屬性試驗(yàn) 精密量取供試品原液、陰性對(duì)照原液各3 ml，對(duì)照品貯備液2 ml，分別置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋定容，旋勻，臨用時(shí)，用0.45 μm孔徑針頭濾器過濾，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A-對(duì)照品;B-供試品;C-陰性對(duì)照品;1-蒙花苷

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備液0.30、0.60、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00和10.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，旋勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，以蒙花苷溶液的濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=4.331×104C－2.949 ×103(n=5，r=0.999 9)。結(jié)果表明，蒙花苷在2.95～98.3 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且理論板數(shù)符合規(guī)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 取蒙花苷對(duì)照品溶液(29.5 μg/ ml)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定6次，結(jié)果峰面積的RSD為0.67%，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)的支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒6份，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品原液，分別精密量取3.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋定容，用0.45 μm孔徑針頭濾器過濾，按“2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣測(cè)定，代入“2.4”項(xiàng)下的回歸方程計(jì)算樣品含量，結(jié)果測(cè)得樣品平均含量為0.195 μg/mg，RSD為1.10%?？梢姺椒ǖ闹貜?fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在涼處放置，與0、4、24、48、96 h依法測(cè)定，結(jié)果測(cè)得峰面積的RSD為1.01%。表明供試液在4日內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知蒙花苷含量為0.195 μg/mg，制劑批號(hào)為20101201的支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒供試品溶液(100.855 mg/ml)2.00 ml 15份，置于10 ml量瓶中，分成3組，每組重復(fù)5份，分別精密加入39.3 μg/ml蒙花苷對(duì)照液0.60、1.00、1.36 ml，加甲醇稀釋定容，旋勻，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=15)

2.9 樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)的供試品5批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，作適當(dāng)稀釋，過濾后進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)峰面積法和“2.4”項(xiàng)下的回歸方程計(jì)算蒙花苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 檢測(cè)成分考察 支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒含小薊、麥冬和側(cè)柏葉等藥材，這些成分中有豐富的黃酮類屬物成分，筆者曾經(jīng)檢測(cè)出二氫黃酮類［1］;有報(bào)道可檢測(cè)小薊中蘆丁［4］，含小薊的制劑文獻(xiàn)報(bào)道也以蘆丁為測(cè)定指標(biāo)［3］，而在筆者的實(shí)驗(yàn)研究中，用紫外光譜法和HPLC法均未測(cè)出。不同批次支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒中蒙花苷含量比較接近，說明小薊中富含的黃酮是蒙花苷，且含量比較穩(wěn)定，可以將蒙花苷作為本制劑質(zhì)量控制定量指標(biāo)之一。中國(guó)藥典一部2010年版與2005版比較，在薄層色譜鑒別中將蘆?。?］修訂為蒙花苷［4］，含量測(cè)定項(xiàng)增訂高效液相色譜法測(cè)定蒙花苷［4］，筆者研究驗(yàn)證了這次增修訂是正確、可行的。

3.2 提取溶劑與提取方法選擇 曾經(jīng)采用石油醚(60～90℃)脫脂或不脫脂，以甲醇或65%乙醇為提取溶劑，索氏提取器回流或超聲提取，分別考察所制取的供試品溶液的色譜結(jié)果，實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)石油醚回流脫脂，甲醇回流提取，所得供試品溶液與流動(dòng)相有良好的互溶性，色譜雜峰少，且提取最完全。

3.3 流動(dòng)相選擇 考察了甲醇-水-冰醋酸(55∶45∶0.3)，(45∶54.5∶0.5)［4］，(52∶46∶2)［4］和(55∶44∶2)等數(shù)組溶劑系統(tǒng)，結(jié)果前3組蒙花苷色譜峰峰形欠佳，測(cè)定中有理論板數(shù)較低，經(jīng)多次試驗(yàn)，以甲醇-水-冰醋酸(55∶44∶2)為流動(dòng)相，不僅峰保留時(shí)間適宜、分離度好，而且理論板數(shù)最高，峰形相對(duì)最好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 比較了蒙花苷HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm［4］和334 nm［4，5］處測(cè)得的峰面積，結(jié)果以326 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)峰面積大，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為326 nm。

［1］ 吳文飛，李玉平.紫外分光光度法測(cè)定支擴(kuò)養(yǎng)陰顆粒中二氫黃酮的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22(43):4083.

［2］ 崔敬浩，楊星昊，丁安偉，等.小薊、小薊炭中黃酮類成分的含量測(cè)定和薄層鑒別［J］.四川中醫(yī)，2006，24(3):32.

［3］ 祝德秋，羅啟劍，崔 嵐，等.連錢草-小薊混合粉中總黃酮的含量測(cè)定［J］.華西藥學(xué)雜志，2003，18(6):477.

［4］ 中國(guó)藥典2005版.一部［S］.2005:32，45，308，295.

［5］ 柯 睿，朱恩圓，侴桂新.小薊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(7):1662.