不同提取方式下小薊、小薊炭提取物抗炎、凝血活性的比較

竺 靜，陳晶晶，姚佳寧

（浙江舟山群島新區(qū)旅游與健康職業(yè)學(xué)院，浙江舟山 316111）

小薊Cirsium setosum(Willd.)MB.，又名刺兒菜，為多年生菊科草本植物，性味甘、苦、涼，歸心、肝經(jīng)。傳統(tǒng)藥學(xué)記載生品涼血、消腫效果較強，炒炭后，收斂、止血作用增強[1]。入藥成分為地上干燥部分。利用現(xiàn)代技術(shù)提取和研究小薊藥用成分，研究表明，小薊具有止血、凝血、抗菌、抗炎的藥理活性，對心血管系統(tǒng)有一定的作用[2-5]。小薊中總黃酮、正丁醇、咖啡因和綠原酸等有機成分被認為其有效藥理學(xué)成分[6，7]。在小薊有效成分中黃酮總含量在3%左右，有些地區(qū)小薊草中其含量高達16%[8]，其中驗證的黃酮種類有刺槐素(acacetin)、蒙花昔(linarin)、白楊素(chrysin)和黃琴昔(baicalin)等成分[9]。同時，小薊草中也含有大量的有機酸類的物質(zhì)，有原兒茶酸（protocatechuic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）等[10]。其他有效成分還有生物堿類、木脂素類物質(zhì)和大量的植物甾醇類物質(zhì)。目前，臨床使用分為生品和炒炭兩種形式。有效成分中黃酮在抗炎活性和凝血活性方面有很好的作用，綠原酸及咖啡酸使局部血管收縮在促進血液凝固方面起重要的作用?，F(xiàn)臨床上小薊在治療衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外傷出血、癰腫瘡毒等方面有顯著的作用[11-12]，是中醫(yī)臨床常用藥之一。中草藥提取方法有多種，其中以水為溶劑的煎煮法就是其中一種，目前，相關(guān)文獻報道大多是利用化學(xué)提取法提取和分析小薊化學(xué)成分及相關(guān)的藥理作用。本文采用煎煮法、超聲波化學(xué)提取法，以小薊生品和小薊炭為研究對象，探究兩種提取方式在抗炎、止血方面的藥理學(xué)差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

新鮮小薊，6月份采摘當?shù)匾巴猓〉厣喜糠?，晾干備用（簡稱小薊鮮干品或鮮小薊）；小薊炭，購于當?shù)刂兴幍辏欢妆?，國藥集團化學(xué)試劑廠；檸檬酸二鈉，上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈣，天津致遠化學(xué)致遠有限公司；昆明小鼠18～22 g，雌雄各半，廣東維伯鑫生物科技有限公司(提供實驗鼠許可證號)，打孔器，電子分析天平；上海立辰儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 小薊提取混懸液制備

1.2.1.1 小薊水煎液制取

稱取小薊鮮干品50 g，搗碎，按5倍的量加入蒸餾水浸泡，4℃水箱內(nèi)放置24 h后，加熱100℃30 min，過濾，將濾渣再加5倍水加熱 100℃ 30 min，過濾并將兩次濾液混合加熱濃縮至50 mL，生藥含量為1 g·mL-1，調(diào) pH值為7.6，離心后留取上清，進行高壓滅菌。

1.2.1.2 小薊炭水煎液提取

稱取小薊炭50 g，搗碎，按5倍的量加入蒸餾水浸泡，4℃水箱內(nèi)放置24 h后，100℃加熱30 min，過濾，將濾渣再加 5倍水加熱 100℃30 min，過濾，并將兩次濾液混合加熱濃縮至50 mL，生藥含量為1 g·mL-1，調(diào) pH為7.6，離心后留取上清，進行高壓滅菌。

1.2.1.3 小薊超聲波提取混懸液

取小薊鮮干品粉末50 g，搗碎，加95%乙醇500 mL，浸漬24 h，低頻超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣按照樣品：1：10比例添加95%乙醇，超聲處理30 min，過濾。如此反復(fù)提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓至適量，備用，按照濃度約為1 g·mL-1，加入生理鹽水，高壓滅菌備用。

1.2.2 小鼠耳廓腫脹實驗

昆明小鼠，雌雄各半，40只，隨機分配均分4組，即：空白對照組，小薊水煎組，小薊炭水煎組，小薊超聲提取混懸液?？瞻讓φ战M灌胃同體積的生理鹽水，其它3組分別灌胃各組相應(yīng)提取液，給藥劑量2 mL·10-1·g，每天固定時間分2次。3 d后，末次給藥45 min后，在小鼠右耳以0.05 mL·只-1劑量，涂抹二甲苯，左耳做為對照組，脫頸處死，將雙耳剪下，打孔器（直徑8 mm）打孔，電子分析天平稱重，以左耳右耳的質(zhì)量差為腫脹度，并計算抑制率，取平均值。抑制率公式為：

抑制率=（NS組腫脹-給藥腫脹）/NS組腫脹×100%。

1.2.3 小鼠腳爪腫脹實驗

分組、灌藥方法同1.2.2，末次給藥60 min后，自左足跖中部皮下向上注入1%角叉菜0.05 mL，然后掉轉(zhuǎn)針頭向下注0.05 mL，測定爪腫脹量，右足不做處理，作為參照，計算方式方法同上。

1.2.4 體外抗凝血實驗

實驗分組如1.2.2，每組10只小鼠。取各組提取物1 mL于5 mL試管，每組加入3滴檸檬酸二鈉；小鼠眼圈取血后，加入1 mL與各組試管內(nèi)，然后加入25 μL 0.2 mol·L-1CaCl2混勻后，開始計時。先靜置1 min，然后每隔30 s傾斜試管，至血液凝聚不能流動，則停止計時，記錄各組凝血時間，每組測定4個樣本。同時做小薊炭凝血試驗，方法同上。

2 結(jié)果

2.1 小鼠耳廓腫脹實驗

實驗結(jié)果如圖1所示，小薊水煎液、小薊炭水煎液、小薊超聲提取混懸液對小鼠耳廓腫脹抑制率分別是13.14%、3.97%、18.11%?？梢姡∷E超聲提取混懸液組對小鼠耳廓腫脹抑制率最高，小薊水煎液阻抑制率次之，小薊炭水煎液組抑制率最低。比較之間抑制率顯著性差異，小薊水煎液組抑制率與小薊炭水煎液組抑制率之間存在顯著差異（P＜0.05），與小薊提取物之間也存在顯著性差異（P＜0.05），另外小薊炭水煎液和小薊超聲提取混懸液的抑制率也存在顯著差異（P＜0.05），3組不同提取物對小鼠耳廓腫脹的抑制各不相同。

圖1 各組提取物對小鼠耳廓腫脹抑制率Fig.1 Inhibition rate of extracts from each group on ear

2.2 小鼠腳爪腫脹實驗

實驗結(jié)果如圖2所示，新鮮小薊水煎液、小薊炭水煎液、小薊超聲提取混懸液對小鼠腳爪腫脹抑制率分別是11.93%、5.27%、23.66%?？梢姡∷E超聲提取混懸液對小鼠腳爪腫脹抑制率最高，小薊水煎液抑制率次之，小薊炭水煎液抑制率最低。比較之間抑制率，鮮小薊組抑制率與小薊炭煎劑抑制率之間存在顯著差（P＜0.05），與小薊超聲提取混懸液之間也存在顯著性差異（P＜0.05），小薊炭煎液和小薊超聲提取混懸液的抑制率也存在顯著差異，3組對小鼠腳爪腫脹的抑制率各不相同。

圖2 各組提取物對小鼠腳爪腫脹抑制率Fig.2 Inhibition rate of swelling on paw of mice in each group

2.3 小鼠體外凝血試驗

實驗結(jié)果如圖3所示，空白對照組、新鮮小薊水煎液、小薊炭水煎液、小薊超聲提取混懸液、小薊碳粉在體外凝血試驗中，測定凝血時間分別是 1.875 min、1.125 min、1.5 min、0.825 min、1.075 min。其中空白對照組所用的時間最長，小薊炭粉所用的時間最短。實驗干擾各組凝血時間明顯要小于空白對照組（P＜0.05），其中鮮小薊水煎液、小薊炭水煎液、小薊超聲提取混懸液3組凝血時間之間差異性不大（P＞0.05），小薊超聲提取混懸液、小薊炭粉之間凝血時間差異性不大（P＞0.05）。小薊炭煎劑和小薊炭粉之間凝血時間有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 小鼠體外凝血時間測定Fig.3 Determination of coagulation time in mice

3 討論

本實驗中，采用傳統(tǒng)藥物提取方式煎煮法和現(xiàn)代超聲提取法分別小薊、小薊炭進行粗提，探究不同提取方式下，小薊、小薊炭提取物之間在抗炎與凝血方面的藥理活性的差異性。由實驗結(jié)果知，不同的提取方式，對小鼠耳廓、腳爪腫脹的抗炎效果與空白對照都存在顯著差異（P＜0.05），說明2種提取方式都能有效提取小薊中的抗炎藥效成分。孟永海等[13]認為黑龍江產(chǎn)的小薊提取部位能顯著地減輕由二甲苯所致地小鼠炎癥反應(yīng)，具有很好的抗炎作用，且總黃酮部位顯著抑制實驗性炎癥，小薊的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和總黃酮部位具有不同程度的止血、凝血和抗炎作用[3]。本實驗結(jié)果與文獻報道一致。此外，實驗中超聲波乙醇法提取的提取物的抗炎效果明顯優(yōu)于煎煮法得到的小薊提取物的抗炎效果（P＜0.05）。這說明超聲波乙醇提取法從小薊中提取的有效抗炎成分效果優(yōu)于煎煮法。另外同樣利用煎煮方式提取小薊和小薊炭的有效成分，耳廓和腳爪腫脹模型中，抗炎作用方面新鮮小薊的提取物的抗炎作用優(yōu)于小薊炭提取物的抗炎活性，兩者有顯著差異（P＜0.05）。這可能與小薊經(jīng)過炭化后，有效藥學(xué)成分發(fā)生了改變[7]。因此采用超聲波提取的小薊抗炎成分的抗炎效果較好。

中醫(yī)的研究與發(fā)展過程中一直認為小薊味微苦、甘，性涼，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，有凝血祛瘀、止血的作用。常用于治療各種血癥和金瘡等病癥。在《食療本草》中表述小薊為“取菜煮食之，除風熱。根，主崩中，又女子月候傷過，搗汁半升服之；金瘡血不止，葉封之。”《本草拾遺》：“破宿血，止新血，暴下血，血痢，金瘡出血，嘔吐等，絞汁溫服?！笨梢娦∷E具有凝血、止血和抗炎的藥理作用。小薊使局部血管收縮發(fā)揮止血功能，小薊有效止血成分是有機酸類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)。早有學(xué)者研究稱黃酮苷類成分有止血作用，如蘆?。╮utin），在防治視網(wǎng)膜出血和急性出血性腎炎等炎癥方面起作用，柳穿魚苷（pectolinaron）的止血活性較強。有機酸類物質(zhì)有原兒茶酸（protocatechuic acid）、咖啡酸（protocatechuic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）等同樣有止血效果，可以縮短凝血時間[14]。王志強[15]制備小薊炭的綠原酸含量為5.38%，且經(jīng)多次測定后，在180℃烘10 min時，所得成品中綠原酸含量較高且保持穩(wěn)定。楊星昊等[16]驗證了小薊原料中不同有效成分對小鼠凝血和止血時間，以及實驗性炎癥作用的影響，此外，稱小薊的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和總黃酮部位具有不同程度的止血、凝血和抗炎作用。本實驗三種提取物的抗凝血測定中，空白對照組凝血時間明顯大于鮮小薊水煎液、小薊炭水煎液、小薊超聲波提取混懸液的凝血時間（P＜0.05），說明不同提取物都有明顯止血效果，不同提取方式都能提取小薊中有效止血成分。3組凝血作用效果為：超聲波乙醇法提取小薊的混懸液的凝血活性最好，煎煮小薊提取物次之，煎煮小薊炭提取物效果不佳。小薊的抗凝血活性趨勢和抗炎活性趨勢一致。孫雷雷等[17]指出，小薊在炭化后，抗炎、止血的有效成分黃酮減少，酸性成分增加。黃酮類是小薊最重要有效成分，抗炎和止血方面都發(fā)揮主要作用。實驗中3種提取物的抗炎、止血實驗結(jié)果可知，在同樣的提取方式下，小薊炭煎煮作用效果均小于生品作用，可能與炭化后，黃酮成分減少有關(guān)，煎煮方式提取更進一步減少了有效成分釋出，導(dǎo)致效果最差。

小薊炭被普遍認為止血效果良好傳統(tǒng)藥材。據(jù)文獻報道稱炒炭后的小薊中的咖啡酸，綠原酸含量高于小薊段中的含量，這可能是小薊炭提取物發(fā)揮凝血止血功效的原因之一[17]?？赡茉蚴切∷E在炒炭過程中，高溫破壞黃酮類物質(zhì)，且隨溫度的升高被破壞的越嚴重，這是小薊炭中幾乎不含黃酮類成分，但含有咖啡酸、綠原酸、原兒茶等成分卻較多。本實驗通過測定，小薊炭提取物的凝血時間最短，可能是小薊炭粉中成分完全，有效的發(fā)揮作用有關(guān)，另外一方面活動炭具有吸附、收斂作用，炭化后植物中的鈣在高溫下更容易游離出來，在Ca2+離子作用下，凝血效果增強[18]。再加上血液中水分被炭吸收，血液中凝血因子濃度增加，促進凝血系統(tǒng)作用啟動，從而凝血效果比較顯著，小薊超聲波提取混懸液凝血時間1.076 mim，與之差異不大，可見超聲提取方式能夠有效提取藥材有效成分。

綜合抗炎、凝血實驗結(jié)果比較，小薊超聲波提取混懸液作用效果最佳，這可能與超聲波的機械、空化效應(yīng)等作用下，草藥中有效的成分能夠充分釋放，有效成分提取率較高有關(guān)[19]。因此，通過本實驗結(jié)論在藥材成分提取研究方面可作為一個有價值的參考。