NR3亞單位的研究進展

朱敏俠 朱大年

NMDA受體屬于配體門控陽離子通道。傳統(tǒng)NMDA受體主要由NR1亞單位和不同的NR2亞單位組成。NR1是形成NMDA受體的基本亞單位，NR2為調(diào)節(jié)亞單位。NR1亞單位上有甘氨酸結(jié)合位點，NR2亞單位上有谷氨酸結(jié)合位點。NMDA受體激活的條件是:神經(jīng)細胞膜去極化使結(jié)合于通道內(nèi)的Mg2+移出，同時甘氨酸和谷氨酸分別與NR1、NR2上相應(yīng)的位點結(jié)合。受體激活后，除Na+和K+通透性增加外，主要引起Ca2+通透性增加，Ca2+大量內(nèi)流。內(nèi)流的Ca2+對于突觸可塑性、腦的學(xué)習(xí)和記憶功能，以及腦卒中和癲癇等神經(jīng)退行性變都具有重要意義［1～4］。最早關(guān)于NR3亞單位的報道見于1995年，研究發(fā)現(xiàn)它不影響非NMDA受體(KA和AMPA受體)所產(chǎn)生的電流，而是可能特異地與NMDA受體亞單位相互作用形成新型受體，并產(chǎn)生不同于傳統(tǒng)NMDA受體的新特性。

一、NR3亞單位的結(jié)構(gòu)

1.1995年，由兩個研究小組分別報道了NR3A，最初被命名為χ－1(chi－1)或NMDAR－L(NMDAR－like)［5，6］。人的 NR3A 開放閱讀框由 9 個外顯子編碼，編碼基因GRIN3A位于染色體9p34，有1115個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為125kDa。NR3A與NR1具有27%的同源性，與NR2具有24% ～29%的同源性，與非NMDA受體亞單位具有23%的同源性。盡管同源性低，但NR3A仍被歸為NMDA受體，這是因為它的羧基末端及M1上游與其他NMDA受體亞單位結(jié)構(gòu)相關(guān)［5］。NR3A具有谷氨酸受體家族共有的特性，包括1個4次跨膜結(jié)構(gòu)域形成的孔道、胞外氨基末端配體結(jié)構(gòu)域以及編碼信號肽的疏水區(qū)和糖基化作用位點、1個胞內(nèi)羧基末端。與其他NMDA受體亞單位一樣，胞內(nèi)羧基末端有蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)、蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的磷酸化位點。這提示在NR3A的轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和通道特性的調(diào)節(jié)上，磷酸化可能起到重要的作用［7］。已在大鼠證實，NR3A mRNA至少存在兩種變體，即羧基末端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域第3007位核苷酸處有1個60bp插入片段的長剪接變體(NR3－long;NR3－l)，和沒有插入片段的短剪接變體(NR3－short;NR3－s)。人的NR3A基因序列中沒有此插入片段。NR3－l的插入片段可形成20個氨基酸殘基，上有 PKA、PKC和CaMKⅡ的磷酸化位點［8］。人和大鼠NR3A亞單位在氨基酸水平上同源性較高，約為93%，大多數(shù)糖基化和磷酸化位點高度保守;但大鼠NR3A羧基末端缺少富含脯氨酸的序列，因此不能和突觸后致密區(qū)腳手架蛋白的PDZ(PSD－95/discs large/zona occludens－1)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，含NR3A亞單位的受體在突觸的聚集和穩(wěn)定還要依賴NR2亞單位和PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，這也解釋了含有NR3A亞單位的NMDA受體表達不穩(wěn)定的原因;而人NR3A胞內(nèi)羧基末端有人類特異的羥脯氨酸序列，可以結(jié)合腳手架蛋白的SH3(Src homology 3 domain)結(jié)構(gòu)域［9］。

2.2001～2002年，有關(guān)NR3B亞單位的功能特性有了較為全面的報道［10～12］，最初被命名為 χ －2。人NR3B的可讀框由9個外顯子編碼，編碼基因GRIN3B位于染色體19p13.3，有1043個氨基酸殘基。小鼠NR3B的開放閱讀框有1003個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為109.2kDa;大鼠NR3B的可讀框有1002個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為109kDa。NR3B和NR3A約有47%的同源性，與NR1、NR2的同源性為17%～21%，與非 NMDA受體家族的同源性為13% ～16%［11］。人NR3B基因全長有9165 bp，小鼠為6205 bp，這種差異主要是由于人基因中有較長的內(nèi)含子造成的。人NR3B的氨基酸序列有74.9%與小鼠相同，而其他6個NMDA受體亞單位的氨基酸序列約有89.0% ～99.8%與小鼠相同。特別是人NR3B的外顯子9翻譯出的氨基酸序列比小鼠長很多，相同序列只有37.8%。人NR3B外顯子9編碼兩個CaMKⅡ位點和兩個PKC位點，這在小鼠是沒有的。大多數(shù)其他的糖基化和磷酸化位點在種屬之間具有保守性［13］。NR3B具有谷氨酸受體氨基末端典型的跨膜拓撲結(jié)構(gòu)，4個膜聯(lián)結(jié)構(gòu)域和N－糖基化位點。小鼠NR3B胞內(nèi)羧基末端有3個蘇氨酸殘基和5個絲氨酸殘基，這可能是磷酸化位點。羧基末端以丙氨酸－谷氨酸－絲氨酸結(jié)尾，缺少其他谷氨酸受體和PDZ結(jié)合的結(jié)構(gòu)域［10］。通過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，沒有與NMDA受體亞單位的同源基因序列，所以NR3B很可能是NMDA受體家族的最后1個成員。NR3B具有NMDA受體家族高度保守結(jié)構(gòu)，包括S1和S2的激動劑結(jié)合域和跨膜結(jié)構(gòu)。NR3B和NR3A相似，在M2區(qū)有離子通道孔，這與NR1和NR2明顯不同。NR3A和NR3B的這些特點可能賦予NMDA異聚體未知的配體結(jié)合和門控特性［11］。

二、NR3亞單位的表達分布

1.通過對大鼠出生后NR3A蛋白表達的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在生后第2天，大腦皮質(zhì)、海馬和中腦的NR3A蛋白水平已很高，在第7～10天達到高峰，隨后下降，第30天降至穩(wěn)定水平，第42天仍能檢測到。在生后第2天，小腦NR3A表達水平最高，隨后下降，在第10天降至成年水平。于生后第5天，嗅球NR3A蛋白水平達到高峰，然后下降至成年水平。在生后第7天，小腦和嗅球的NR3A蛋白水平約為皮質(zhì)、中腦和海馬的25%，這個比率在小腦、嗅球和中腦、海馬之間一直維持到成年。于生后第42天，小腦NR3A蛋白水平最低。NR3A的表達具有時間和空間特點，總體來看，在胚胎發(fā)育后期，NR3A轉(zhuǎn)錄水平增加，并在出生后前2周達到高峰，主要在脊髓、腦干、下丘腦、背側(cè)丘腦、海馬CA1區(qū)和杏仁核，隨后迅速下降。在成年大鼠，其高表達主要是在背側(cè)丘腦和杏仁核。這個亞單位的瞬時表達說明它在早期神經(jīng)元分化、遷移和突觸形成的過程中起重要作用［5，14］。

2.通過對C57BL/6J小鼠NR3B mRNA表達的研究，發(fā)現(xiàn)NR3B主要在運動神經(jīng)元表達。從孕15天的胚胎至生后7天的小鼠，NR3B mRNA在腦和脊髓，包括三叉神經(jīng)運動核、面神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核尚未有表達，而在出生后第14天，這些腦干運動核開始表達，直至成年［10，15］。起初認為 NR3B 的表達非常局限，主要在脊髓、腦干、小腦和海馬［11］。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NR3B在大鼠前腦(海馬、大腦皮質(zhì)、基底核節(jié)區(qū)和付核)、小腦和脊髓腰段都有廣泛表達。在這些區(qū)域，如海馬CA1、CA3和齒狀回、大腦皮質(zhì)的各層、投射神經(jīng)元、紋狀體的中間神經(jīng)元、小腦的各型細胞上，以及脊髓的運動神經(jīng)元都有表達，且與NR1共表達［16］。

三、NR3亞單位賦予NMDA受體新特性

在瓜蟾卵母細胞上，NR3A或NR3B可同NR1形成受甘氨酸調(diào)節(jié)的興奮性受體NR1/NR3A或NR1/NR3B。NR3亞單位上有甘氨酸結(jié)合位點，所以含有NR3亞單位的受體對甘氨酸敏感且親和力高，但不受谷氨酸和NMDA的影響，對Mg2+、MK－801和美金剛以及競爭性拮抗劑均不敏感，對Ca2+相對通透。此型受體激活后產(chǎn)生的內(nèi)向電流比傳統(tǒng)NMDA受體小。傳統(tǒng)NMDA受體NR1亞單位上甘氨酸位點的激動劑，如D－絲氨酸、D－丙胺酸、D－環(huán)絲氨酸和1－氨基環(huán)戊烷羧酸，對NR1/NR3B受體甘氨酸誘導(dǎo)的電流產(chǎn)生有抑制作用。當(dāng)沒有甘氨酸作用時，D－絲氨酸可單獨激活NR1/NR3B受體，但與甘氨酸的激活效應(yīng)相比，作用較弱。對于NR1/NR3A受體來說，D－絲氨酸是1個強拮抗劑，單獨作用也不能產(chǎn)生激動效應(yīng)。也有文獻報道，在瓜蟾卵母細胞上未檢測到功能性的NR1/NR3A受體，這可能是由于甘氨酸激活NR1/NR3A受體產(chǎn)生的電流快速失敏所造成的［11］。

上述甘氨酸在含有NR1/NR3A或NR1/NR3B的瓜蟾卵母細胞上誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)向電流的現(xiàn)象，尚未在轉(zhuǎn)染了這兩型受體的哺乳動物細胞上被觀察到。在HEK293細胞，NR1/NR3A或NR1/NR3B受體不能在甘氨酸或谷氨酸誘導(dǎo)下產(chǎn)生電流，但是NR1/NR3A/NR3B可在甘氨酸誘導(dǎo)下產(chǎn)生較強的門控電流。盡管和NR1亞單位一樣，NR3亞單位也結(jié)合甘氨酸，但當(dāng)NR1缺乏或被NR2取代時，將不能產(chǎn)生內(nèi)向電流，說明NR1對于NR1/NR3A/NR3B是非常重要的。該受體不被谷氨酸或紅藻氨酸激活，也不受甘氨酸受體或甘氨酸轉(zhuǎn)運體拮抗劑的影響，許多傳統(tǒng)的NMDA受體拮抗劑，如 2－amino－5 phosphonovalerate(APV)、艾芬地爾、美金剛、MK－801等都不能阻斷該受體。APV和艾芬地爾不能發(fā)揮作用是因為它們要和NR2亞單位的位點結(jié)合。通道阻斷劑美金剛、MK－801不能發(fā)揮作用是因為NR1/NR3A/NR3B受體上的通道結(jié)構(gòu)域不同于傳統(tǒng)的NMDA受體。傳統(tǒng)的NMDA受體甘氨酸位點激動劑D－絲氨酸可以部分激活NR1/NR3A/NR3B受體，拮抗劑5，7－dichlorokynurenic acid(5，7DCK)可以阻斷受體電流［17］。

P8小鼠頂枕皮質(zhì)神經(jīng)元上的NMDA受體在NMDA誘導(dǎo)下，其單通道電流減小，對Mg2+不敏感，可被APV阻斷，這些特性不能歸于傳統(tǒng)NMDA受體或NR1/NR3受體，所以推測，這可能是NR1/NR2/NR3受體所特有的。采用NR3A轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NR1/NR2/NR3A受體對Mg2+不敏感，Ca2+內(nèi)流減少［18］。瓜蟾卵母細胞上也可形成NR1/NR2A/NR3A和NR1/NR2A/NR3B受體，這些受體在NMDA/甘氨酸作用下所產(chǎn)生的電流與傳統(tǒng)NMDA 受體相比較?。?1］。

四、NR3亞單位的作用及與疾病的關(guān)系

1.研究表明，與野生型小鼠相比，敲除內(nèi)源性NR3A后小鼠的NMDA電流幅度增大，樹突棘密度增加［19］，突觸成熟加快，而NR3A的持續(xù)表達會通過限制突觸生長和減少棘突密度來阻止谷氨酸能突觸的成熟，并伴有學(xué)習(xí)和記憶過程的損害。但重要的是，隨后突觸和認知缺陷可以恢復(fù)，提示只要NR3A表達恢復(fù)正常，突觸也會適時成熟。NR3A獨特的瞬時表達特點使它就像一個管家，保證出生后腦發(fā)育過程中突觸在適當(dāng)?shù)臅r候成熟［20］。大鼠脊髓也有豐富的NR3A表達，表明在一些感覺處理過程中含有NR3A的NMDA受體的重要性［9］。

在NR3A基因敲除小鼠和野生型小鼠的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)過程中，用不同濃度的NMDA加上5μmol/L甘氨酸誘導(dǎo)細胞發(fā)生興奮性毒性損傷。與野生型小鼠比較，當(dāng)NMDA濃度在100或200μmol/L時，NR3A基因敲除小鼠的神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)目明顯增多，梗死面積明顯增大，成年后中樞神經(jīng)系統(tǒng)極少高表達NR3A，但視網(wǎng)膜位列其中。成年NR3A基因敲除小鼠及野生型小鼠視網(wǎng)膜中注入NMDA，7天后觀察視神經(jīng)節(jié)細胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NMDA濃度為2nmol時，NR3A基因敲除小鼠存活的視神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目小于野生型小鼠的75%。用NR3A轉(zhuǎn)基因小鼠制作大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，NR3A轉(zhuǎn)基因小鼠的腦梗死面積明顯減小，且神經(jīng)行為學(xué)評分比野生型小鼠高。這些研究結(jié)果均表明NR3A具有神經(jīng)保護作用［21］。

有報道觀察到精神分裂癥者的前額葉皮質(zhì)背外側(cè)(dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC)NR3A mRNA表達增加，但僅限腦回區(qū)域，而在雙向情感障礙者，NR3A mRNA于整個前額葉皮質(zhì)背外側(cè)區(qū)表達都減少［22］。但也有文獻報道，精神分裂癥者 DLPFC區(qū)NR3A的表達和正常對照組比較沒有差異，但與男性比較，女性DLPFC區(qū)NR3A表達顯著降低，提示雌激素可以下調(diào)NR3A的水平［23］。

2.在對NR3B的研究中發(fā)現(xiàn)，NR3B過表達會增加樹突的長度、錯綜程度和樹突足的數(shù)量，提示NR3B可以促進發(fā)育中的運動神經(jīng)元長出更多的分支［24］。

通過NR3B亞單位是否會影響重組NMDA受體麻醉敏感性的研究發(fā)現(xiàn)，盡管NR3B的摻入會顯著減小NR1/NR2受體通道的電流幅度，但是NR1/NR2/NR3B受體對氯胺酮、異氟醚、氧化亞氮和乙醇的敏感性沒有改變。NR3A的作用可能和NR3B相同［25］。

NMDA受體除了在神經(jīng)細胞表達外，還在其他細胞上表達，如NR3B mRNA在外周血淋巴細胞上表達。通過對阿片類藥物成癮研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，戒斷組、阿片成癮組和美沙酮維持組的 NR3B mRNA表達明顯上調(diào);然而，與戒斷組和成癮組比較，美沙酮維持組NR3B mRNA表達明顯下調(diào)。慢性阿片濫用可導(dǎo)致成癮個體NR3B mRNA表達明顯上調(diào)，含有NR3B的NMDA受體可以通過減少通道對鈣離子通透性而抑制受體的活動。因此，成癮個體外周血淋巴細胞NR3B的上調(diào)可造成這些細胞NMDA受體轉(zhuǎn)運活動的抑制。美沙酮維持治療可以減少外周血淋巴細胞NR3B亞單位的過表達，因此NR3B可以用作評估治療成功與否的標(biāo)志［26］。

NR3B基因敲除小鼠的社會行為可發(fā)生改變，表現(xiàn)為在它們自己鼠籠內(nèi)與熟悉同伴的社交活動增多，但在新環(huán)境中出現(xiàn)焦慮樣行為中度增多伴隨社交活動減少。這些社會行為的改變與NR3B在NMDA受體功能上的負性調(diào)節(jié)有關(guān)［27］。

五、結(jié) 語

在哺乳動物的不同成長發(fā)育階段，NR3亞單位的表達特點使之可能參與新型NMDA受體的構(gòu)成，并表現(xiàn)出不同于傳統(tǒng)NMDA受體的新特性，對于機體的正常生理發(fā)育和在某些疾病狀態(tài)下都具有重要意義。近來年尤其受到關(guān)注的是，在一些由NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性損傷的疾病中，通過調(diào)節(jié)含有NR3受體的表達來減少Ca2+內(nèi)流引起的神經(jīng)元損傷，可為疾病的治療找到新靶點，這也是今后研究的方向。

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