絲素蛋白在組織工程中的應(yīng)用和降解性研究

袁 凱

絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)廣為應(yīng)用。經(jīng)過幾十年的研究應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)絲纖維在許多臨床應(yīng)用當(dāng)中都有應(yīng)用價(jià)值。然而與此同時(shí)，這種蛋白會(huì)引起一些生物反應(yīng)，這就對其生物相容性提出了質(zhì)疑。經(jīng)過大量的研究，明確認(rèn)識到蠶絲表面的絲膠蛋白是在蠶絲的生物相容性和超敏反應(yīng)中引起不良反應(yīng)的主要因素。如果將蠶絲外層的絲膠蛋白去掉，機(jī)體對剩余的絲素蛋白(絲心蛋白)的生物反應(yīng)就與其他大部分常用的生物材料相似。另外，有學(xué)者認(rèn)為蠶絲不能降解。但現(xiàn)在已經(jīng)有明確的證據(jù)證明，蠶絲作為一種蛋白，在體內(nèi)對蛋白水解酶的降解作用很敏感，并且經(jīng)過更長的時(shí)間會(huì)被慢慢的吸收。

一、組織工程支架

組織工程需要各種不同性能的生物材料，從而滿足體外組織實(shí)驗(yàn)的需求。生物材料在將環(huán)境信息傳給基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞方面發(fā)揮了重要的作用。在原有環(huán)境和新的組織之間，生物材料起到橋梁作用，幫助新的組織發(fā)揮其生物學(xué)作用。生物材料必須能夠支持細(xì)胞黏附、擴(kuò)散、生長和分化。大多數(shù)情況下，如果生物材料可以降解為宿主細(xì)胞能夠代謝的生物碎片或單體會(huì)更好，但是，降解速度必須等于或者小于組織的生長速度。二者之間的平衡可以確保宿主機(jī)體和新的植入組織在物理和生理方面更好的完成整合。

1.絲素蛋白的生物相容性:在組織工程基質(zhì)支架設(shè)計(jì)中，蠶絲絲素蛋白具有廣泛的用途，包括骨、韌帶、肌腱、血管和軟骨組織工程，其良好生物學(xué)作用是成功的關(guān)鍵因素。Inouye等證實(shí)了絲素蛋白膜與膠原基質(zhì)一樣，都具有支持細(xì)胞的生長和生物學(xué)功能［1］。Minoura等用L－929成纖維細(xì)胞系來比較絲素蛋白膜、絲膠蛋白膜和膠原基質(zhì)在支持細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和生長方面的能力。結(jié)果說明，絲素蛋白膜和膠原基質(zhì)膜在支持細(xì)胞黏附、生長和細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的能力相同，而絲膠蛋白則沒有相同的功能［2］。因此去除了絲膠蛋白的絲素蛋白適合作為培養(yǎng)細(xì)胞和組織的基質(zhì)。Sufia等的研究發(fā)現(xiàn)，在體外將成骨細(xì)胞培養(yǎng)在絲素蛋白膜上，可以誘導(dǎo)骨組織生長［3］。如果在體外用RGD(Arg2Gly2Asp)肽段對絲素蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾來促進(jìn)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，那么誘導(dǎo)骨形成的能力將會(huì)顯著增強(qiáng)。4周后，這種作用將會(huì)依賴升高的堿性磷酸酶水平、上調(diào)的骨特異性因子、以及鈣離子的水平。

2.絲素蛋白在韌帶組織工程中的應(yīng)用:在組織工程中蛋白質(zhì)的功能是提供多種位點(diǎn)來進(jìn)行特異性的化學(xué)偶聯(lián)，絲素蛋白就有這種優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在關(guān)于蠶絲蛋白的研究集中在自體組織工程領(lǐng)域，將其加工成線狀基質(zhì)，利用病人自己的成人干細(xì)胞，從而形成前交叉韌帶(ACL)［4］。韌帶強(qiáng)勁的性能，膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)性，這些對生物材料的生物相容性和強(qiáng)大的機(jī)械性能都有很嚴(yán)格的要求。模擬體內(nèi)環(huán)境，在體外將人骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)在膠原基質(zhì)中，可以誘導(dǎo)形成韌帶成纖維細(xì)胞和成熟的組織。然而，膠原基質(zhì)的整合性比較差，膝關(guān)節(jié)內(nèi)的動(dòng)力環(huán)境和生化要求比較高，另外蠶絲具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，人們認(rèn)為蠶絲是一種長遠(yuǎn)的有前途的可吸收材料。

Dunn等［5］做了一項(xiàng)研究，他用膠原制備了ACL修復(fù)體。結(jié)果顯示，在兔子模型中有不連續(xù)的新生韌帶形成，該修復(fù)體機(jī)械性能也很差。人們開始研究改進(jìn)的支架材料如膠原纖維－PLA復(fù)合體，希望其具有新生韌帶組織生長過程中所需要的機(jī)械性能。在這兩項(xiàng)研究中，支架置入4周后只有一半的結(jié)構(gòu)保持完整，這就說明了膠原纖維－PLA復(fù)合體無法滿足ACL體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的要求。蠶絲特有的機(jī)械性能，以及可以被制成線狀的特點(diǎn)，使人們可以更好地控制最后制得的纖維的機(jī)械性質(zhì)，從而模仿ACL在體內(nèi)的機(jī)械特點(diǎn)，支持宿主組織向支架內(nèi)生長，這就為ACL組織工程提供了新的途徑。

3.絲素蛋白在骨組織工程中的應(yīng)用:以骨組織來說，優(yōu)良的生物材料必須能夠抵抗壓力，而我們知道蠶絲在壓力下功能狀態(tài)良好，很少出現(xiàn)斷裂或破碎的情況，此時(shí)其他合成的高性能纖維往往就會(huì)失敗［6］。采用電紡絲的方法制的絲素蛋白支架能支持骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附和增殖，而且Kim等的研究表明采用這種方法獲得的納米纖維膜能夠引導(dǎo)骨再生［7，8］。將骨形成蛋白－2載入絲素蛋白膜后可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向骨分化，該細(xì)胞能高表達(dá)堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白、骨涎蛋白、骨橋蛋白、骨鈣素和 cbfa1［9］。目前學(xué)者仍在探索，希望能夠找到一種理想的基質(zhì)材料，這種基質(zhì)材料能滿足所要求的幾何形狀和硬度，從而能有效的支持體外和體內(nèi)組織的生長。

4.絲素蛋白在軟骨組織工程中的應(yīng)用:成人的軟骨是一種無血管的組織，因而自修復(fù)能力較差。自體細(xì)胞移植軟骨組織工程可用于治療由創(chuàng)傷和骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨組織損傷。該組織工程技術(shù)需要三維的多孔支架提供軟骨細(xì)胞生長和分化以及新的軟骨特異性基質(zhì)的形成。絲素蛋白已被用于體外軟骨組織工程［10～12］。采用鹽溶解的方法可制備多孔的三維絲素蛋白支架［13］，將骨髓基質(zhì)細(xì)胞置入三維絲素蛋白支架3周后形成了關(guān)節(jié)周圍的2型膠原［14］。Uebersax等的研究表明，載有胰島素生長因子的絲素蛋白支架能支持骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長，緩釋的胰島素生長因子誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成軟骨方向分化［15］。

二、絲素蛋白的降解

按照美國藥典的說法，可吸收材料是指在置入體內(nèi)60天內(nèi)大部分拉伸強(qiáng)度會(huì)喪失的材料。按照這個(gè)定義，蠶絲是屬于非降解性的。然而，許多文獻(xiàn)表明，蠶絲是降解性的，只是要很長時(shí)間，其降解性是FBS(胎牛血清)介導(dǎo)的蛋白水解作用引起的。體外研究證明，糜蛋白酶可以將蛋白質(zhì)結(jié)晶較少的區(qū)域水解為多肽，多肽再被細(xì)胞吞噬掉從而進(jìn)一步的被消化［16］。在蛋白酶 －14的作用下，絲素蛋白24天可降解65%，而在PBS(磷酸鹽)緩沖液中則無降解［17］。在皮下種植的老鼠模型中，蠶絲在植入后第10天喪失了29%的拉伸強(qiáng)度，在第30天喪失了73%，在第70天喪失了83%［18］。Lam等認(rèn)為蠶絲具有生物降解性，該研究將干紡熱拉的聚乳酸纖維與幾種可吸收非降解性縫線置入老鼠皮下的肌肉層中。掃描電鏡觀察PLLA(聚L乳酸粒子)，PDS(聚對苯二氧雜環(huán)己酮纖維)，Vicryl和黑色編織蠶絲在體內(nèi)2周后便有降解的跡象。除了單股尼龍纖維，其他所有的縫線在第2周時(shí)都會(huì)誘發(fā)慢性的炎癥反應(yīng)。第24周，在體內(nèi)即沒有蠶絲，也沒有炎癥反應(yīng)，這很可能是由于蛋白水解酶將蠶絲快速的消化了。到第6周，置入Vicryl的機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)已經(jīng)消失，第80周，機(jī)體置入的PLLA周圍仍有慢性的炎癥反應(yīng)［19］。一般來說，蠶絲在機(jī)體內(nèi)吸收的比較慢。置入位點(diǎn)、物理環(huán)境、可變因素、蠶絲類型(有沒有去除絲膠蛋白)以及蠶絲纖維的直徑均決定了吸收速度，其中可變因素包括病人的生理狀況和健康狀況［20］。另外，蠶絲加工處理方法不同也會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這就可能會(huì)使其更容易降解或者更難降解［21］。這些變量都沒有詳細(xì)的研究，因此很難確定蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)、加工方法和降解性之間的關(guān)系。但蠶絲蛋白在體內(nèi)可以降解，以上所涉及的變量不同，降解率也不同。

鑒于絲素材料良好的生物相容性，用絲素蛋白做人造血管、人造皮膚等器官一直受到廣大學(xué)者的青睞。關(guān)于絲素膜燒傷覆蓋材料的研究，通過測定絲素膜的含水率、斷裂強(qiáng)度、柔韌性、透水性、創(chuàng)面黏合力等各種物理和生物學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其具有一定的透水性，并能與創(chuàng)面產(chǎn)生良好的初期黏合。絲素膜用做人工皮膚的愿望也指日可待。在今后的研究中，多孔絲素膜將能引導(dǎo)新生血管長入，誘導(dǎo)真皮組織的再生，在真皮再生過程中多孔絲素膜逐步被降解，成為真皮再生的支架和真皮的永久性替代物。

目前被期待的絲素生物醫(yī)學(xué)材料大都屬于軟組織用材料，要求材料有一定的柔韌性。但是目前除了絲素膜之外，絲素材料的柔韌性和強(qiáng)度等還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到生物醫(yī)學(xué)材料實(shí)用性的要求。因此，許多學(xué)者利用各種化學(xué)改性的方法，如交聯(lián)等，來提高材料的強(qiáng)度和柔韌性。

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