TRPA1介導(dǎo)哮喘和咳嗽機(jī)制的研究進(jìn)展

楊建林 武 陽 丁書茂 陳如沖 楊 旭 賴克方

哮喘主要是由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞參與的慢性呼吸道炎癥。特應(yīng)性機(jī)體接觸過敏原后誘導(dǎo)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放前列腺素、組胺、白三烯、血小板活化因子等介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮，黏液分泌增加，血漿滲出和黏膜水腫，引發(fā)急性與慢性支氣管哮喘［1］。使用TRPA1的阻斷劑，能明顯降低氣道高反應(yīng)性，減輕哮喘與咳嗽的癥狀。肥大細(xì)胞釋放因子激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，Th1型細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ、IL－2、TNF－β等，Th2型細(xì)胞產(chǎn)生IL－4、IL－ 5、IL －6、IL －10、IL－13 等，這兩種 Th1和Th2產(chǎn)生一些共同的細(xì)胞因子 IL－1、IL－3、IL－8、TNF－ α、GM－CSF 等［1］。在 TRPA1缺失和 HC －030031阻斷情況下嗜酸性粒細(xì)胞、IL－5、嗜酸細(xì)胞趨化因子、TNF－α、IL－13、RANTES、MCP－1釋放減少［2］。因此，哮喘與咳嗽的誘發(fā)是由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與的惡性循環(huán)，刺激物通過激活TRPA1受體，引發(fā)一系列的反應(yīng)，誘發(fā)呼吸道疾病。

一、TRPA1膜蛋白的研究進(jìn)展

TRPA1，又稱 ANKTMI蛋白，歸屬于 TRP家族。2003年由Story等在小鼠DRG、三叉神經(jīng)節(jié)中首次發(fā)現(xiàn)，而且97%的TRPA1與TRPV1是共表達(dá)的，溫度低于17℃能被激活，是一種冷痛覺感受器［3］。ANKTMI蛋白主要在初級(jí)感覺神經(jīng)元表達(dá)，外周神經(jīng)系統(tǒng)中主要存在于成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞，肺組織ANKTM1跨膜蛋白也表達(dá)在成纖維細(xì)胞［4］。Stokes等研究顯示，TRPA1在心臟肌細(xì)胞、胃腸黏膜、腦、腎上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞、皮膚等組織上表達(dá)，而且在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、人類乳腺細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、PC12、HT22、IMR90、大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞上表達(dá)［5］。最近的研究顯示，在內(nèi)耳纖毛細(xì)胞中也有表達(dá)，并參與聽覺傳導(dǎo)［7］。在人的ANKTM1跨膜蛋白由1119個(gè)氨基酸組成，老鼠的ANKTM1蛋白由1125個(gè)氨基酸組成，其人的染色體定位為8q13，人的 ANKTM1跨膜蛋白相對(duì)分子質(zhì)量是127.379kDa［4］。ANKTM1跨膜蛋白有6個(gè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)孔道組成，其中S6區(qū)是激活劑與拮抗劑結(jié)合必須的位點(diǎn)，N末端包含有14個(gè)與錨蛋白結(jié)合的部位，N末端有1個(gè)EF手性鈣結(jié)合域，能夠增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子［8］。溫度、機(jī)械力、環(huán)境刺激物激活TRPA1產(chǎn)生疼痛、機(jī)械損傷、神經(jīng)炎癥［7］。TRPA1可被辣根、肉桂醛、大麻、蒜素、芥末、質(zhì)子等眾多外源性有機(jī)小分子激活，但是對(duì)薄荷醇無反應(yīng)［9］。最近研究顯示，TRPA1通道能被多種環(huán)境化學(xué)刺激物激活，這些刺激物包括異氰酸酯、丙烯醛、甲醛、氯氣等［10］。運(yùn)用鈣離子及熒光成像技術(shù)對(duì)大量化學(xué)物激發(fā)TRPA1通道能力進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性化合物4－HNE、ROS、RNS 能激活 TRPA1 通道［11］。一些化合物也能通過激活細(xì)胞其他受體，激活PLC與PKA兩條信號(hào)通路激活TRPA1通道，如緩激肽、NGF等，最近的研究推斷TRPA1與配體之間是共價(jià)鍵的相互作用，而不是傳統(tǒng)的受體與配體的相互作用，如甲醛、乙醛、4 －ONE、4 －HNE、15d －PGJ2、PGA2、8 － 異 －PGA2等，這些化合物可能發(fā)生巰基反應(yīng)激活TRPA1［12］。

二、TRPA1與哮喘的研究進(jìn)展

支氣管哮喘是一種常見呼吸系統(tǒng)疾病，是有多因素誘發(fā)的疾病。多年來哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為呼吸道最為嚴(yán)重的疾病之一。目前研究顯示，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，將釋放包括CGRP、SP、神經(jīng)激肽A。反過來，這些物質(zhì)能會(huì)導(dǎo)致支氣管收縮，激活肥大細(xì)胞，釋放炎性因子，誘發(fā)哮喘。刺激誘發(fā)哮喘的多數(shù)化合物能激活 TRPA1，如甲醛、氯氣等［9］。而且TRPA1的激動(dòng)劑，能使炎性因子上調(diào)，這和哮喘的發(fā)生相通。通過基因敲除TRPA1小鼠哮喘模型研究，其炎癥因子減少和氣道高反應(yīng)性明顯減輕，在TRPA1缺失和HC－030031阻斷情況下嗜酸性粒細(xì)胞、IL－5、嗜酸細(xì)胞趨化因子、TNF －α、IL －13、RANTES、MCP－1釋放減少［2］。目前的抗哮喘的藥物尚不能完全治愈。因此，弄清楚發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新型、可靠的藥物具有很高的價(jià)值。

1.TRPA1與呼吸道:呼吸道中，ANKTM1跨膜蛋白主要表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)的迷走神經(jīng)和感覺神經(jīng)纖維上;在呼吸道非神經(jīng)細(xì)胞中，在肺組織中的成纖維細(xì)胞中也有表達(dá)，TRPA1與TRPV1共表達(dá)在呼吸道初級(jí)感覺神經(jīng)元上，控制P物質(zhì)、NKA、CGRP的釋放［4，13］，這些物質(zhì)刺激肥大細(xì)胞，影響 T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，進(jìn)而誘發(fā)哮喘。環(huán)境污染物激活TRPA1能誘發(fā)多種呼吸道疾病，包括職業(yè)哮喘、RADS、咳嗽等，TRPA1選擇性激動(dòng)劑肉桂醛激活受體，從支氣管感覺神經(jīng)元產(chǎn)生C－纖維動(dòng)作電位，引起迷走感覺神經(jīng)咳嗽反射［14］。

2.TRPA1與內(nèi)源性因子

(1)活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、次氯酸(ClO－):哮喘的發(fā)生就是一個(gè)氧化應(yīng)激的過程，當(dāng)呼吸道氧化劑和抗氧化劑失衡就能誘發(fā)哮喘［15］。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的肺泡腔，釋放活性氧、活性氮、過氧化氫、次氯酸等，活性氧引起的TRPA1啟動(dòng)，可能是活性氧促進(jìn)鄰巰基形成二硫鍵來影響TRPA1，RNS是NO的供體，NO具有潤(rùn)滑支氣管和抑制產(chǎn)生炎性細(xì)胞信號(hào)蛋白的作用，哮喘病人有高NO合成，ROS通過與NO結(jié)合產(chǎn)生高活性氮RNS，并造成硝化應(yīng)激誘發(fā)哮喘，RNS通過氧化半N－末端半胱氨酸殘基，能直接激活TRPA1［15，16］。H2O2能夠直接激活 TRPA1 受體，F(xiàn)e2+催化H2O2產(chǎn)生的自由基，激活 TRPA1［16］。次氯酸鈉大量存在于發(fā)炎組織中，實(shí)驗(yàn)證明能夠在體外和體內(nèi)激活TRPA1。

(2)前列腺素(prostaglandin，PGs):前列腺素是花生四烯酸被環(huán)加氧酶水解的產(chǎn)物，為二十碳不飽和脂肪酸。體內(nèi)分布廣泛，已發(fā)現(xiàn)10余種，其功能各異。PGE和PGD支氣管有明顯的舒張作用，能刺激咽喉，引起咳嗽。PGD2是肥大細(xì)胞被活化抗原應(yīng)答花生四烯酸代謝產(chǎn)物，人類哮喘發(fā)作過程中PGD2被大量釋放，在哮喘過程中，它已作為肥大細(xì)胞活化標(biāo)志，PGD2可抑制血小板凝聚、血管擴(kuò)張、支氣管平滑肌收縮，肥大細(xì)胞釋放的PGD2可以作為過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子［17］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，通過G－蛋白偶聯(lián)信號(hào)刺激DRG，引發(fā)炎性疼痛，主要是激動(dòng)劑與質(zhì)膜上的特異受體結(jié)合，激活PLC，PIP2水解產(chǎn)生IP3及DAG，再由DAG激活PKC，IP3增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［18］，鈣離子濃度上升激活TRPA1。環(huán)戊前列素又名 PGA2、PGA1、PGJ，經(jīng)過進(jìn)一步代謝產(chǎn)生12－PGJ2和15－ d－PGJ2。在與 TRPA1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)戊前列素通過TRP通道途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元，15d－PGJ2通過激活 TRPA1，引發(fā)疼痛動(dòng)作反應(yīng)［19］;環(huán)戊前列素能夠誘發(fā)鈣離子大量涌入表達(dá)TRPA1的CHO細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元;使用阻斷劑后疼痛消弱，鈣離子內(nèi)流減少［20］?？傊傲邢偎貐⑴c哮喘的發(fā)生，其中可能是通過激活TRPA1引起。

(3)內(nèi)生醛(R－CHO):人類機(jī)體自身也能產(chǎn)生醛，不同的細(xì)胞、不同的組織含量不同。脂質(zhì)過氧化生成醛含量最豐富的是丙二醛、4－HNE、丙烯醛、己醛［21］。4－HNE在肺組織由花生四烯酸、亞油酸及其衍生物分解產(chǎn)生的α，β－不飽和醛，體內(nèi)能到達(dá)很高濃度，慢性阻塞性肺病人與吸煙者肺部，測(cè)定4－HNE的水平明顯要高，已被證明4－HNE、丙烯醛能激活TRPA1，在呼吸道產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛和炎癥，丙烯醛和4－HNE激活TRPA1的機(jī)制，涉及TRPA1的N－端的結(jié)構(gòu)域賴氨酸殘基共價(jià)修飾［11］。內(nèi)源性甲醛主要是由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，細(xì)胞核內(nèi)的甲醛主要是DNA甲基化和脫甲基化產(chǎn)生。體內(nèi)甲醛含量的異常升高，可以造成嚴(yán)重的呼吸道疾?。?2］。內(nèi)源性飽和醛，如甲醛和乙醛，都能激活小鼠神經(jīng)元和重組表達(dá)的 TRPA1，并引起的疼痛［23］。

(4)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF):神經(jīng)生長(zhǎng)因子是神經(jīng)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育必需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放，導(dǎo)致氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、支氣管重塑［24］。嚴(yán)重哮喘患者的血清、肺泡灌洗液、支氣管黏膜中神經(jīng)生長(zhǎng)因子呈上升趨勢(shì)。NGF可由多種神經(jīng)細(xì)胞與免疫細(xì)胞分泌，如神經(jīng)元與巨噬細(xì)胞。NGF通過誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥參與誘發(fā)哮喘，涉及到TrkA的受體、TRPV1、TRPA1的激活促進(jìn)咳嗽及呼吸道阻塞，NGF與Trk A的免疫球蛋白IgG C2區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致Trk A的酪氨酸殘基自身磷酸化，活化PLC與PKC通路，激活TRPV1與TRPA1，在背根神經(jīng)節(jié)中，NGF能夠通過激活p38MAPK通路增加TRPA1的表達(dá)，而抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子或p38 MAPK抑制劑降低了TRPA1表達(dá)，并且抑制炎癥和冷痛覺過敏引起的神經(jīng)損傷［25，26］。

(5)緩激肽(bradykinin，BK):緩激肽是重要的炎性因子，參與痛覺過敏和炎癥反應(yīng)。在哮喘和鼻炎患者，肺泡灌洗液和血清中的緩激肽呈上升趨勢(shì)［27］。緩激肽能夠使HEK293細(xì)胞中表達(dá)的TRPA1和β2電化學(xué)勢(shì)差發(fā)生改變，這個(gè)勢(shì)差可以被PLC和PKA的抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)，緩激肽能通過其β2受體和PLC而激活表達(dá)于CHO細(xì)胞中的TRPA1通道，而在背根神經(jīng)元中，緩激肽可通過其β2受體激活PLC與PKA兩條信號(hào)激活TRPA1通道的作用，緩激肽注射基因敲除TRPA1小鼠未能引起機(jī)械或痛覺過敏，從而表明TRPA1是緩激肽作用必要的［28］。

(6)Ca2+與低氣溫:Ca2+是機(jī)體廣泛存在的離子，TRPA1對(duì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的Ca2+比較敏感［7］。最近研究顯示，Ca2+直接結(jié)合到TRPA1的N－端EF手性Ca2+結(jié)合域，導(dǎo)致通道激活［7］。G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的各種PLC的信號(hào)通路，膜磷脂水解活性的PLC(PIP)生成DAG和三磷酸肌醇(IP3)的，這反過來引起從ER Ca2+的釋放，可能導(dǎo)致 TRPA1激活［8］，脂質(zhì)代謝的PLC，如甘油二酯的，也有助于TRPA1激活。冷激活TRPA1是目前研究有較多爭(zhēng)議，Ca2+參與激活寒冷的敏感性通道，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在未轉(zhuǎn)染TRPA1的HEK293細(xì)胞升高［7］。然而，從最近的研究結(jié)果，低氣溫啟動(dòng)不需要細(xì)胞內(nèi)Ca2。

3.TRPA1與環(huán)境污染物

(1)香煙煙霧:香煙煙霧中含有數(shù)百種復(fù)雜的化學(xué)成分，大部分對(duì)人體有害。吸煙能引起多種呼吸道疾病。暴露在香煙煙霧中的人，誘發(fā)哮喘的概率呈上升趨勢(shì)。香煙煙霧能引起急性哮喘，加快哮喘的發(fā)作和肺功能下降。香煙煙霧誘發(fā)的哮喘體內(nèi)與體外研究表明，具有較高中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。在嚙齒類動(dòng)物，吸入的香煙煙霧造成神經(jīng)性血漿蛋白外泄，是由于辣椒素敏感的感覺神經(jīng)元釋放神經(jīng)肽P物質(zhì)和神經(jīng)激肽引起，然而，香煙煙霧引起的血漿蛋白外滲的不是通過TRPV1受體介導(dǎo)的，因?yàn)門RPV1選擇性拮抗劑CZP不能抑制外滲，最近的研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧提取物CSE、不飽和巴豆醛、丙烯醛，都能激活TRPA1受體。因此可以得出結(jié)論，香煙煙霧引起氣道神經(jīng)性炎癥，是通過TRPA1刺激介導(dǎo)的，不飽和醛是香煙煙霧中的主要誘導(dǎo)物質(zhì)。

(2)其他空氣污染物:空氣污染是現(xiàn)代城市生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重的問題，工業(yè)生產(chǎn)與人類生活排放大量空氣污染物，直接影響人類的正常生活。而其中一些化合物極易揮發(fā)、光解，經(jīng)過一系列反應(yīng)，產(chǎn)生NO、O3、醛等混合物，引起呼吸道疾病。例如油漆、農(nóng)藥等光解釋放的醛類可以導(dǎo)致哮喘。氯氣、甲醛［10］、異氰酸酯等化合物是被廣泛使用的化合物，人體吸入可導(dǎo)致多種呼吸道疾病和組織損傷，例如咳嗽、鼻炎、咽喉發(fā)炎、呼吸困難、胸悶等。其中丙烯醛、NO、甲醛等都直接或間接激活TRPA1。最近研究表明，次氯酸鹽類激活在HEK293細(xì)胞中表達(dá)TRPA1通道，次氯酸鈉引發(fā)TRPA1敲除的小鼠呼吸不良反應(yīng)明顯降低。甲醛能誘發(fā)哮喘，甲醛可能通過促進(jìn)P物質(zhì)的釋放而調(diào)控多種肥大細(xì)胞功能，低濃度甲醛單獨(dú)作用可導(dǎo)致低水平的組胺釋放，甲醛致痛反應(yīng)是由TRPA1通道所介導(dǎo)的，通過鈣離子成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)甲醛能夠引起背根神經(jīng)元中TRPA1通道的開放，使用TRPA1通道的特異性阻斷劑或TRPA1基因敲除后，均能顯著抑制甲醛所引起動(dòng)物的雙相痛覺過程［10］。甲苯二異氰酸酯是低分子、易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)，工業(yè)上被廣泛使用，對(duì)呼吸道的刺激嚴(yán)重，可引起哮喘性氣管炎和支氣管哮喘，是引起職業(yè)性哮喘的重要化合物，最近研究顯示，TRPA1可以調(diào)節(jié)甲苯二異氰酸酯引起的呼吸疾病，它能激活呼吸道感覺神經(jīng)元上的TRPA1誘發(fā)呼吸道反應(yīng)，但對(duì)基因敲除小鼠無反應(yīng)。因此推測(cè)，空氣污染物誘發(fā)哮喘可能是直接或間接通過激活TRPA1引起。

三、TRPA1和咳嗽

感覺神經(jīng)纖維密集的分布于上皮細(xì)胞層從鼻到下呼吸道，感應(yīng)呼吸系統(tǒng)的刺激性和潛在有害物質(zhì)，將啟動(dòng)一系列反應(yīng)，旨在保護(hù)肺免受傷害?？人源矸伪Ｗo(hù)的最強(qiáng)大的機(jī)制之一。打噴嚏、咳嗽、黏液分泌是呼吸系統(tǒng)接受外界刺激清除有害物質(zhì)的一種自身保護(hù)反射。在哮喘發(fā)病早期階段，大約有5%～6%是以持續(xù)性咳嗽為主要癥狀的，咳嗽變異性哮喘是常見的，是多種激素參與的氣道反應(yīng)［14］。研究顯示，TRPA1與TRPV1是咳嗽反射主要的靈敏元件，而TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8 還沒有足夠的證據(jù)參與咳嗽反應(yīng)，豚鼠吸入TRPA1興奮劑肉桂、異硫氰酸酯等，引起強(qiáng)烈的咳嗽反應(yīng)，鎮(zhèn)咳藥物樟腦和慶大霉素可以抑制TRPA1，而起到鎮(zhèn)咳作用，HC－030031可以完全阻斷咳嗽，TRPV1受體拮抗劑CZP卻不能完全阻斷咳嗽。吸入香煙煙霧的豚鼠咳嗽能被釕紅、樟腦、HC－030031抑制，根據(jù)結(jié)論推斷，吸煙引起的咳嗽可能是由煙霧中的自由基、丙烯醛、巴豆醛等激活TRPA1引發(fā)。TRPA1將發(fā)展為新型鎮(zhèn)咳藥物的靶點(diǎn)。

四、小 結(jié)

隨著研究的不斷深入，哮喘與咳嗽的發(fā)病機(jī)制將越來越清晰。從目前的研究來看，TRPA1在哮喘和咳嗽的發(fā)生中扮演一個(gè)重要的作用。誘導(dǎo)哮喘與咳嗽的化合物，無論是細(xì)胞內(nèi)源因子，還是外源因子，都能激活TRPA1。激活TRPA1，究竟是配體與受體結(jié)合，還是化學(xué)鍵之間的相互作用，還存在很多爭(zhēng)議。TRPA1的拮抗劑能夠減輕哮喘癥狀，能阻斷氣道高反應(yīng)性。慶大霉素、釕紅、阿米洛利TRPA拮抗劑顯示在對(duì)體外表達(dá)TRPA1有效，但體內(nèi)效果不是很好。TRPA1選擇性拮抗劑HC－030031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中抑制緩激肽誘導(dǎo)的機(jī)械痛、甲醛縮腿反應(yīng)、OVA致敏小鼠水腫。鑒于TRPA1幾個(gè)病理生理?xiàng)l件作用，可以預(yù)見在不久的將來，新型拮抗劑數(shù)量將大幅增加。

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