白介素-1β在緩激肽開放血腦屏障過(guò)程中的作用及其機(jī)制

秦麗娟，薛一雪，谷艷婷，張志勇，張 田，孫 娜，王東春，宋鴻艷

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110001;2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北唐山063000;3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110016;4.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，

5.河北聯(lián)合大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山 063000;6.赤峰市松山醫(yī)院內(nèi)科，內(nèi)蒙古赤峰 024005)

化學(xué)療法在人體其他部位腫瘤的治療中取得了肯定的效果，但在腦膠質(zhì)瘤的治療中卻存在著很多問(wèn)題。最主要的原因在于腦組織中存在血腦屏障，且在腫瘤組織中同樣存在血腫瘤屏障，使得化療藥物不易達(dá)到腫瘤部位，從而給臨床上腦膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)了很大困難［1－2］。目前對(duì)于膠質(zhì)瘤的化療主要集中在先將血腦屏障和血腫瘤屏障打開，再將化療藥物注入體內(nèi)，使化療藥物能夠通過(guò)開放的屏障進(jìn)入腫瘤組織。打開血腦屏障可以用高滲性藥物如甘露醇等，但是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種高滲性藥物雖然可以使血腦屏障開放，但其開放不具選擇性，甚至往往只能開放正常血腦屏障，而對(duì)血腫瘤屏障影響不大［3］。最近，國(guó)外研究［4－7］發(fā)現(xiàn)，將緩激肽 B2 受體激動(dòng)劑與卡鉑聯(lián)合作用于腦組織可選擇性開放血腫瘤屏障，并在臨床Ⅱ期試驗(yàn)中得到了證實(shí)。但有關(guān)緩激肽(bradykinin，BK)選擇性開放血腦屏障的確切機(jī)制迄今尚不明了。

1 材料與方法

1.1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞及分組 大鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6由美國(guó)UCLA提供。用高糖的DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)C6細(xì)胞，37℃孵箱孵育，并通以5%的CO2。至細(xì)胞增殖至109·L－1，培養(yǎng)的C6細(xì)胞分別于給予緩激肽(1 μmol·L－1)后 10、30、60、120、180和240 min時(shí)取培養(yǎng)液2 ml于 EP管，－70℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)IL-1β含量。細(xì)胞用胰酶消化后收集于EP管，－70℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)HSF1的表達(dá)及IL-1β mRNA水平。

1.2 C6細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)IL-1β含量 用放射免疫法測(cè)定C6細(xì)胞培養(yǎng)液和腦膠質(zhì)瘤組織中IL-1β的含量，試劑盒購(gòu)自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。操作方法按照試劑盒內(nèi)的操作指南進(jìn)行。

1.3 C6細(xì)胞內(nèi)HSF1蛋白表達(dá)及IL-1β mRNA水平測(cè)定 采用Western blot法檢測(cè)C6細(xì)胞內(nèi)HSF1的蛋白表達(dá)(rat monoclonal anti-HSF1購(gòu)自Neomarkers公司)，RT-PCR法測(cè)定C6細(xì)胞內(nèi)IL-1β mRNA水平(試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用Wistar健康♂大鼠，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2003-0009，體質(zhì)量200～220 g，隨機(jī)分為:注射 IL-1β 及緩激肽后 10、30、60、120、180和240 min組。

1.5 C6膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的建立及血腦屏障通透性測(cè)定 收集培養(yǎng)的C6細(xì)胞1×105/5 μl通過(guò)立體定向儀接種于動(dòng)物大腦右側(cè)尾狀核，約15 d成瘤。

IL-1β處理組:成瘤后的動(dòng)物以10%水合氯醛(3 ml·kg－1)麻醉后，首先經(jīng)尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)(購(gòu)自 Fluka公司)2 ml·kg－1，然后用微量輸液泵經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈給予IL-1β(每組動(dòng)物給藥終濃度為:給予緩激肽后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)C6細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)IL-1β的增加量)，并分別于給藥后10、30、60、120、180和240 min時(shí)斷頭取腦，解剖顯微鏡下去除額極和枕極各2 mm，分離左右半球，稱取左右半球濕重后，按0.1 ml·g－1腦組織加入甲酰胺溶液，60℃孵育24 h。提取液在分光光度計(jì)λ=632 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織伊文思藍(lán)含量(μg·g－1wwt)，間接測(cè)定血腦屏障通透性。

緩激肽處理組:實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程同前，緩激肽注射量為 10 μg·kg－1·min－1。

2 結(jié)果

2.1 各組C6細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量變化 給予緩激肽后，C6細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量開始逐漸增加，120 min達(dá)高峰，以后又隨時(shí)間推移而減少，且給予緩激肽后C6細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量較給予生理鹽水(NS)組明顯增加(如Tab 1)。

2.2 C6細(xì)胞內(nèi)IL-1β的mRNA水平 細(xì)胞給予緩激肽后，IL-1β的mRNA水平開始升高，60 min達(dá)高峰，以后又隨時(shí)間推移而逐漸減少(如Fig 1)。

2.3 C6細(xì)胞內(nèi)HSF1的表達(dá) 細(xì)胞給予緩激肽后，HSF1三聚體的表達(dá)于第30 min迅速達(dá)高峰，以后隨時(shí)間推移而減少，但仍明顯高于對(duì)照組(Fig 2)。表明C6細(xì)胞在緩激肽作用下，HSF1由無(wú)活性的單體形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘娜垠w形式而被激活。

Fig 1 IL-1β mRNA levels of C6 cells after bradykinin treatment(n=15)

Tab 1Contents of IL-1β in the nutrient fluid of C6 cells by BK(μg·L－1，±s，n=15)

Tab 1Contents of IL-1β in the nutrient fluid of C6 cells by BK(μg·L－1，±s，n=15)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 BK group vs NS group

Group Time after BK treatment/min 10 30 60 120 180 240 Concentrations after NS 1.39 ±0.06 1.08 ±0.128 1.54 ±0.12 1.26 ±0.12 1.07 ±0.05 1.38 ±0.09 Concentrations after BK 2.60 ±0.05 5.55 ±0.51* 10.59 ±0.96* 14.49 ±0.78＊＊ 8.71 ±0.84* 6.90 ±0.38*Release values of IL-1β 1.21 ±0.02 4.47 ±0.39 9.05 ±0.66 13.23 ±0.85 7.64 ±0.79 5.52 ±0.28

2.4 緩激肽組與對(duì)照組大鼠的腫瘤組織內(nèi)IL-1β含量 實(shí)驗(yàn)大鼠注射緩激肽后，瘤組織內(nèi)IL-1β含量開始增加，于120 min時(shí)達(dá)高峰后開始減少。而對(duì)照組動(dòng)物腦組織內(nèi)的IL-1β含量未見明顯變化(Fig 3)。

2.5 血腦屏障通透性 動(dòng)物注射IL-1β及緩激肽后伊文思藍(lán)含量增加，且均于120 min時(shí)達(dá)高峰，其后隨時(shí)間推移而減少，但仍高于對(duì)照組(Fig 4)，說(shuō)明緩激肽引起血腦屏障開放程度最大時(shí)，腫瘤組織內(nèi)IL-1β含量也最多。

Fig 2 HSF1 trimer expression in C6 cell after bradykinin treatment(n=15)

Fig 3 IL-1β concentrations of neurospongioma after BK treatment(n=8)

Fig 4 Evans blue concentrations of neurospongioma after BK/IL-1β treatment(n=8)

3 討論

緩激肽是近年發(fā)現(xiàn)的可選擇性開放血腦屏障的藥物［8－10］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給RG2腦膠質(zhì)瘤大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注射小劑量緩激肽(10 μg·kg－1·min－1)可選擇性地增加腦腫瘤對(duì)示蹤劑(分子質(zhì)量100～70 000 u)的通透性，且分子越大，作用越強(qiáng)［11］。在臨床觀察中也證實(shí)了其選擇性開放血腦屏障的作用［4］，但有關(guān)其開放血腦屏障的確切機(jī)制目前尚不十分明了。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈小劑量緩慢注射緩激肽，可選擇性增加C6膠質(zhì)瘤模型大鼠的血腦屏障通透性，且緩激肽作用于培養(yǎng)的C6細(xì)胞后，培養(yǎng)液中IL-1β含量增加，于120 min達(dá)高峰，這與緩激肽開放血腦屏障峰值相一致。由此推測(cè)緩激肽開放血腦屏障可能與緩激肽促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放IL-1β有關(guān)。為此我們又測(cè)定了C6大鼠給予緩激肽后腫瘤組織內(nèi)IL-1β含量，發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤內(nèi)IL-1β含量隨給予緩激肽時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，同樣于120 min達(dá)高峰，以后又隨時(shí)間推移而減少，進(jìn)一步說(shuō)明緩激肽開放血腦屏障可能與IL-1β有關(guān)，而且很可能是緩激肽通過(guò)刺激C6細(xì)胞釋放IL-1β所引起。其后我們應(yīng)用了C6細(xì)胞給予緩激肽后培養(yǎng)液中不同時(shí)間點(diǎn)的IL-1β濃度來(lái)觀察動(dòng)物模型血腫瘤屏障通透性，發(fā)現(xiàn)以最大IL-1β濃度(即給予緩激肽后120 min時(shí)培養(yǎng)液的IL-1β增加量)作用于膠質(zhì)瘤大鼠，其血腫瘤屏障的通透性最大，進(jìn)一步證實(shí)緩激肽開放血腦屏障的機(jī)制可能是通過(guò)刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放IL-1β所引起的。

有關(guān)緩激肽是如何能引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放IL-1β的，我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其可能與HSF1有關(guān)。眾所周知，任何應(yīng)激都會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生一種保護(hù)性蛋白質(zhì)HSP70，緩激肽作為一種應(yīng)激刺激同樣會(huì)引起體內(nèi)HSP70的產(chǎn)生。合成HSP70受HSF1的調(diào)控，HSF1通過(guò)與熱休克元件(HSE)結(jié)合并使之發(fā)生磷酸化，激活hsp70基因，HSP70表達(dá)增多。通過(guò)對(duì)hsp70和IL-1β基因啟動(dòng)子同源性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，IL-1β基因啟動(dòng)子中也含有與hsp70基因上游相同的完整HSE序列。HSF1能特異性結(jié)合到IL-1β基因啟動(dòng)子的“HSE”序列上，且親和力與HSF1對(duì)hsp70基因的 HSE 結(jié)合類似［12］，HSF1與 IL-1β 基因啟動(dòng)子的“HSE”序列結(jié)合同樣會(huì)影響IL-1β基因的表達(dá)。因此，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中觀察了C6細(xì)胞在給予緩激肽后的HSF1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)給予緩激肽后的C6細(xì)胞，其HSF1的表達(dá)于30 min達(dá)高峰，而IL-1β基因的表達(dá)于60 min達(dá)高峰，推測(cè)這可能是由于緩激肽作為一種應(yīng)激刺激首先引起HSF1蛋白表達(dá)增加，增加的HSF1蛋白再與IL-1β基因啟動(dòng)子的“HSE”序列結(jié)合，從而使IL-1β基因的表達(dá)和釋放增多，進(jìn)而引起血腦屏障開放。

有關(guān)緩激肽開放血腦屏障的機(jī)制研究正在一步步展開，我們也一直在致力于此方面的研究工作。相信隨著對(duì)此方面研究的進(jìn)一步深入，一定會(huì)使緩激肽開放血腦屏障的機(jī)制更加明了，從而實(shí)現(xiàn)在臨床工作中控制并最終治愈膠質(zhì)瘤的目的。

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