芍藥苷通過調(diào)節(jié)前列腺素E2受體抑制大鼠成纖維滑膜細(xì)胞增殖

汪慶童，馬昱琨，黃 蓓，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，安徽合肥 230032)

滑膜炎是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)這一自身免疫性關(guān)節(jié)疾病的特征性病理表現(xiàn)，其中成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)異常增殖活化［1－2］。前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)通過受體 EP(E-prostanoid)2和 EP4介導(dǎo)興奮性G蛋白(stimulatory G protein，Gs)信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平和DNA合成而發(fā)揮致炎作用，是滑膜細(xì)胞活化導(dǎo)致滑膜炎的重要病理機(jī)制之一［3－4］。課題組研究發(fā)現(xiàn)，臨床使用的天然藥物白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)，其活性單體為芍藥苷(paeoniflorin，Pae)，可以降低膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜細(xì)胞中抑制性G蛋白(inhibitory G protein，Gi)的表達(dá)，恢復(fù)cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性［5］。本研究在以往工作的基礎(chǔ)上，從調(diào)節(jié)EP2受體及信號通路的角度，觀察Pae抑制PGE2誘導(dǎo)的大鼠FLS異常增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(120±20)g，♂，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號:皖醫(yī)實動準(zhǔn)字第01號。

1.2 主要試劑 Pae，白色粉末，由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所化學(xué)室提供，高效液相法測純度＞95%(LC-10AD高效液相色譜儀，日本);氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)購于中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所;兔抗大鼠β-arrestin 2和EP2一抗，小鼠抗大鼠β-actin一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和免抗鼠IgG抗體均購于Santa Cruz公司;cAMP放免檢測試劑盒為北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.3 FLS的分離培養(yǎng) 大鼠處死后，置于0.1%新潔爾滅液中浸泡15 min，于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織。用手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織。去除脂肪、纖維等，用D-Hank's液(無 Ca2+、Mg2+，含青霉素200 kU·L－1、鏈霉素 200 mg·L－1)反復(fù)沖洗后剪成 1 ～2 mm3小塊，用玻璃吸管吸取均勻排列于培養(yǎng)瓶(預(yù)先用含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液濕潤)的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，使其貼壁。再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3天換一次培養(yǎng)液，觀察到有大量成纖維細(xì)胞長出后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞快長滿時用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3～5代細(xì)胞用于實驗。

1.4 FLS增殖反應(yīng) 將培養(yǎng)得到的FLS分為正常組、PGE2125 μg·L－1刺激組及 PGE2刺激 +Pae 1、10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1給藥組，作用 24 h。采用3H-TdR參入法，終止培養(yǎng)前6 h每孔加入20 μl3H-TdR，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用液閃儀(LS6500液體閃爍計數(shù)儀，Beckman公司)測其放射性，結(jié)果以3個復(fù)孔cpm的均值表示。

1.5 FLS內(nèi)cAMP濃度檢測 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接種于24孔板，給藥后培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加50 mmol·L－1醋酸緩沖液1 ml終止反應(yīng)，用槍頭將孔底細(xì)胞刮下，移入1.5 ml eppendorf管，細(xì)胞超聲破碎，4℃ 1 200×g離心5 min，取上清液，－20℃保存，按照125I cAMP放免試劑盒說明書進(jìn)行，使用γ-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司生產(chǎn))測定。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測FLS細(xì)胞表面EP2的表達(dá)細(xì)胞給藥處理后，PBS洗滌細(xì)胞1次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌1次后用4%多聚甲醛室溫固定 40 min，2 000 r·min－1離心 10 min，去上清后，用含0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS重懸細(xì)胞，加入兔源性抗EP2受體一抗(1∶50)，37℃孵育30 min，離心去上清重懸沉淀，加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200)37℃避光孵育20 min，網(wǎng)紗過濾后用流式細(xì)胞儀(Beckman FC500)檢測。

1.7 Western blot法檢測 β-arrestin 2胞膜和總表達(dá)以及EP2的總表達(dá) 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接種于6孔板，各組給藥后培養(yǎng)24 h，加入RIPA裂解液后超聲降解，提取總蛋白，100 000 r·min－1離心1 h，沉淀物為胞膜蛋白，用裂解液溶解，加入上樣緩沖液煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h，加抗β-arrestin 2或EP2(1∶1 000)抗體，內(nèi)參用β-actin單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶30 000)37℃孵育2 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實驗重復(fù)3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Pae抑制PGE2誘導(dǎo)的大鼠FLS異常增殖對不同濃度 PGE2(1、5、25、125、615 μg·L－1)作用不同時間(12、24、36、48、60 h)誘導(dǎo) FLS 的增殖預(yù)實驗結(jié)果提示，PGE2125 μg·L－1為刺激的亞適濃度，24 h為最適時間，這一條件用于本實驗。第3代大鼠 FLS 體外用 PGE2125 μg·L－1刺激，同時加入不同濃度的 Pae，培養(yǎng)24 h，3H-TdR參入法檢測 FLS的增殖能力。從Fig 1中可以看出，PGE2明顯促進(jìn)FLS 的增殖(P＜0.01)，Pae 10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1不同程度抑制FLS的增殖。

Fig 1 Effect of Pae on proliferation of PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

2.2 Pae恢復(fù)PGE2降低的FLS內(nèi)cAMP濃度用放免法檢測各

組FLS內(nèi)cAMP水平，如Fig 2所示，PGE2作用24 h后降低了細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度，Pae體外給藥可以逐步升高cAMP濃度，其中Pae 100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1對 cAMP 水平有明顯影響(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 Pae對細(xì)胞膜EP2受體表達(dá)的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度Pae對PGE2作用下FLS細(xì)胞膜EP2受體表達(dá)情況(Fig 3A～E)，去除非特異性染色后，比較X軸平均熒光強度的變化(Fig 3F)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，正常大鼠FLS細(xì)胞膜上EP2受體的平均熒光強度為23.33±4.54，PGE2作用24 h后，EP2胞膜表達(dá)降低(15.23±1.30，與正常組比較P＜0.01)，Pae不同濃度體外給藥升高EP2的胞膜表達(dá)(Pae 1 μmol·L－1為 19.73 ± 1.70，Pae 10 μmol·L－1為20.20 ±2.23)。

Fig 2 Effect of Pae on cAMP concerntration in PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

Fig 3 Effect of Pae on membrane EP2 expression in rat FLS treated by PGE2( ± s，n=4)

2.4 Pae對PGE2誘導(dǎo)的大鼠FLS總β-arrestin 2和EP2以及胞膜β-arrestin 2表達(dá)的影響 大鼠FLS裂解后經(jīng)超速離心，分離出胞膜蛋白，Western blot法檢測細(xì)胞胞膜和總蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PGE2作用下，F(xiàn)LS總β-arrestin 2、EP2以及胞膜β-arrestin 2 表達(dá)均升高，Pae 1、10 μmol·L－1可明顯降低細(xì)胞總EP2和β-arrestin 2的表達(dá)，Pae 3個濃度可不同程度抑制胞膜β-arrestin 2表達(dá)。

Fig 4 Effect of Pae on membrane β-arrestin 2，total EP2 and β-arrestin 2 expression in rat FLS treated by PGE2(±s，n=3)

3 討論

滑膜炎中FLS異常增殖活化，隨之形成血管翳，逐漸向關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨擴(kuò)散、侵蝕，并最終破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，使關(guān)節(jié)畸形而失去功能［6］。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了FLS的異常增殖，研究發(fā)現(xiàn)，作為最大受體超家族的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)介導(dǎo)的信號通路在RA FLS過度增殖中發(fā)揮了重要的作用。關(guān)節(jié)炎動物模型的FLS存在G蛋白的含量變化和功能障礙，cAMP水平和PKA活性降低［7］。EP2和EP4是表達(dá)于滑膜細(xì)胞膜上的重要GPCRs，均與Gs蛋白偶聯(lián)［4］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvantinduced arthritis，AA)大鼠FLS的EP2受體表達(dá)升高［7］，但為何細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性反而降低?本實驗發(fā)現(xiàn)PGE2誘導(dǎo)的大鼠FLS總EP2蛋白表達(dá)升高，與前期研究一致，但細(xì)胞膜EP2受體表達(dá)水平低于正常細(xì)胞，導(dǎo)致對Gs信號激活減弱，cAMP產(chǎn)生減少。

活化的FLS細(xì)胞膜EP2受體為何減少?我們檢測了GPCRs重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子之一β-arrestin 2。β-arrestin與GPCRs激酶(G-protein-coupled receptor kinases，GRKs)聯(lián)合作用，通過介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞，對大部分GPCRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用［8］。當(dāng)GPCRs被激活后，β-arrestin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，結(jié)合到被激動劑占領(lǐng)的受體上，促使這些受體與G蛋白分離，從而導(dǎo)致受體脫敏?；罨摩?arrestin分子釋放出C末端，與胞內(nèi)小泡表面的網(wǎng)格蛋白(clathrin)結(jié)合，介導(dǎo) GPCRs的內(nèi)吞。β-arrestin可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞后GPCRs的運輸模式，在GPCRs循環(huán)中起到了特別的作用［9］。β-arrestin有 β-arrestin 1和2兩個亞型，廣泛的存在于各種細(xì)胞中。β-arrestin 1還可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)直接或間接影響一些轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮更多的功能，βarrestin 2主要介導(dǎo)受體的調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］。CIA大鼠滑膜細(xì)胞β-arrestin 1，2表達(dá)的增高與病程一致，在關(guān)節(jié)炎癥高峰期表達(dá)最高，TGP體內(nèi)給藥抑制FLS中 β-arrestin 1，2 的表達(dá)水平［11］。本實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)活化的FLS總β-arrestin 2和胞膜β-arrestin 2表達(dá)均升高，提示在PGE2刺激下，由于β-arrestin 2產(chǎn)生和募集到胞膜上的量增多，介導(dǎo)了EP2受體的內(nèi)吞，從而降低了Gs下游信號分子cAMP的水平，引起FLS異常增殖。

目前RA的治療效果仍不盡人意，天然藥物因療效肯定，不良反應(yīng)少顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)已經(jīng)作為一個抗炎免疫調(diào)節(jié)藥被正式批準(zhǔn)生產(chǎn)上市，用于治療RA等疾病。前期研究發(fā)現(xiàn)，TGP的主要有效成分Pae可以升高cAMP水平和PKA活性，改善滑膜細(xì)胞功能［12－13］。本實驗觀察到Pae通過減少細(xì)胞膜β-arrestin 2的富集，升高細(xì)胞膜EP2受體水平，改善Gs信號通路，從而提高FLS內(nèi)cAMP水平，抑制PGE2刺激下FLS的過度增殖，這一分子機(jī)制可能部分解釋Pae發(fā)揮作用的分子機(jī)制。然而，Pae如何影響到細(xì)胞內(nèi)的β-arrestin 2，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞表面GPCRs數(shù)量和活性的作用，仍需進(jìn)一步闡明。

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