菝葜治療便秘型腸易激綜合征作用機(jī)制的實驗研究

馬騰飛，王業(yè)秋，張 寧，劉 影，李鐵男

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，黑龍江哈爾濱 150040)

腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome，IBS)，是一種非器質(zhì)性腸道功能紊亂性疾病，以腹痛或腹部不適同時伴排便習(xí)慣及大便性狀改變?yōu)橹饕Y狀。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為 IBS屬于腹痛、泄瀉、便秘范疇［1］。近年來利用中醫(yī)中藥對IBS的臨床治療取得了很大的進(jìn)展，在改善癥狀上療效顯著，且毒副作用小。中藥菝葜(Smilax China L)在民間應(yīng)用歷史悠久，臨床上常用于治療痢疾、腹瀉、消化不良等。但有關(guān)菝葜在治療消化系統(tǒng)疾病的實驗研究較少，而在腸易激綜合征藥物治療的實驗研究中是以腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)的研究居多，對便秘型腸易激綜合征(C-IBS)治療藥物的研究很少。本實驗通過冰水灌胃法建立大鼠C-IBS模型，從血液生化及腸道病理改變等方面探討菝葜治療C-IBS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心提供(動物合格證號:SCXK黑2008004)。

1.1.2 藥物及試劑 菝葜(北京同仁堂制藥集團(tuán)哈爾濱藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳孝忠副教授鑒定)，將菝葜粗末按照1∶10的料液比浸泡在70%乙醇中72 h后超聲提取，提取液過濾后減壓干燥得浸膏，上D101大孔樹脂柱進(jìn)行分離純化，得50%乙醇大孔樹脂洗脫液，干燥、粉碎得固體粉末，置4℃冰箱保存，臨用前用蒸餾水配制成濃度為2 g/ml(低劑量組)、4 g/ml(中劑量組)、8 g/ml(高劑量組)混懸液(按生藥量計);0.9%NaCl注射液(吉林省廣春藥業(yè)有限公司);西沙必利片(山東龍力藥業(yè)有限公司，5 mg/片)，臨用前蒸餾水配制成濃度為0.4 g·L－1的混懸液;大鼠5-HT、SS、SP 酶聯(lián)免疫吸附法測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠5-HT、SS、SP、多克隆一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、二抗為PV6001試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);其他試劑為分析純。

1.1.3 儀器 KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(熱電上海儀器有限公司);HF-90 CO2培養(yǎng)箱(上海智成分析儀器有限公司);TGL-16G-C高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);2135型切片機(jī)(德國萊卡);美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng);電熱恒溫箱(上海一恒);醫(yī)用微波爐。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 用冰水灌胃法建立C-IBS模型［2］，大鼠單籠獨立飼養(yǎng)，每天灌胃給予0～4℃生理鹽水2 ml，造模14 d，觀察14 d(造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大便干硬，大便含水量降低)。

1.2.2 分組及給藥 造模成功后，將模型大鼠隨機(jī)分成模型組、陽性對照組、菝葜提取物高、中、低劑量組，8只/組。另設(shè)空白組8只。各給藥組按體重20 ml·kg－1灌胃給藥，模型組和空白組同步給予生理鹽水，按體重20 ml·kg－1。灌胃給藥3周開始檢測指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測定 末次給藥結(jié)束6 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血、取結(jié)腸、取脊髓腰膨大段。酶聯(lián)免疫吸附法檢測給藥后各組大鼠血清中5-HT含量、血漿中SS、SP含量;對各組大鼠進(jìn)行結(jié)腸5-HT、SS、SP、脊髓腰膨大段SP的免疫組化染色，moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)于400倍視野下攝影，每組隨機(jī)選取10個視野，用Motic image 3.2圖像分析軟件進(jìn)行分析，計算平均灰度值(0～255之間);對各組大鼠結(jié)腸MC進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，用moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)于400倍視野下攝影，每組隨機(jī)選取3個視野，用Motic image 3.2圖像分析軟件進(jìn)行計數(shù)，取平均值，記錄MC每視野數(shù)目。觀察菝葜提取物對模型組大鼠各個指標(biāo)的影響，與空白組和模型組相比較。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 菝葜提取物對C-IBS大鼠血清5-HT含量的影響 結(jié)果見Tab 1。與空白組相比，模型組血清5-HT含量升高(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組血清5-HT含量均呈下降趨勢，其中，陽性對照組和菝葜提取物低劑量組降低(P＜0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

Tab 1 Influence of extract of Smilax China L.on content of 5-HT，SP，SS in blood of rats suffering from C-IBS(±s，n=8)

Tab 1 Influence of extract of Smilax China L.on content of 5-HT，SP，SS in blood of rats suffering from C-IBS(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group SS content/ng·L －1 5-HT content/ng·L －1 SP content/ng·L －1 Blank control group 121.12 ±6.34 158.31 ±14.47 147.30 ±9.61 Model group 131.65 ±6.12△△ 184.49 ±2.90△△ 135.98 ±7.93△△Active control group 122.97 ±3.96＊＊ 174.18 ±4.74* 145.92 ±3.37*High dose group 129.47 ±8.76 183.03 ±5.43 136.12 ±6.51 Middle dose group 129.15 ±5.26 182.91 ±3.49 134.72 ±5.70 Low dose group 122.80 ±3.95＊＊ 175.03 ±8.46* 144.16 ±4.27*

與空白組相比，模型組血漿SS含量升高(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組血漿SS含量均呈下降趨勢，其中陽性對照組和菝葜提取物低劑量組降低(P＜0.01);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

與空白組相比，模型組血漿SP含量下降(P＜0.01);與模型組相比，除菝葜提取物中劑量組外各給藥組血漿SP含量均呈上升趨勢，而菝葜提取物中劑量組血漿SP含量則減少，其中陽性對照組和菝葜提取物低劑量組升高(P＜0.05)、菝葜提取物中劑量則降低但差異無顯著性(P＞0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

2.2 菝葜提取物對C-IBS大鼠結(jié)腸5-HT、SP、SS免疫組化染色的影響 結(jié)果見Tab 2。與空白組相比，模型組結(jié)腸5-HT免疫組化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組免疫組化染色的平均灰度值均呈上升趨勢，其中陽性對照組和菝葜提取物低劑量組升高(P＜0.01);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

Tab 2 Influence of extract of Smilax China L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats colon(±s，n=8)

Tab 2 Influence of extract of Smilax China L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats colon(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group 5-HT SP SS Blank control group 169.70 ±3.59 177.80 ±7.04166.70 ±4.83 Model group 150.90 ±11.11△△165.40 ±11.91△△ 155.20 ±9.93△△Active control group 167.60 ±11.4＊＊ 173.80 ±6.34* 165.50 ±5.97＊＊High dose group 154.10 ±4.36 171.20 ±3.58 156.10 ±11.41 Middle dose group 157.30 ±8.81 168.00 ±7.11 157.60 ±8.54 Low dose group 162.50 ±5.84＊＊ 173.60 ±6.93* 164.00 ±4.94*

與空白組相比，模型組結(jié)腸SP免疫組化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組免疫組化染色平均灰度值均呈上升趨勢，其中陽性對照組和菝葜提取物低劑量組升高(P＜0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

與空白組相比，模型組結(jié)腸SS免疫組化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組免疫組化染色平均灰度值均呈上升趨勢，其中，陽性對照組和菝葜有效成分低劑量組升高(P＜0.01，P＜0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

免疫組化染色的平均灰度值與其染色強度的表達(dá)成反比，即平均灰度值越大染色強度越小，平均灰度值越小，反而染色強度越大。本實驗中結(jié)腸5-HT、SS、SP的免疫組化染色散在的表達(dá)在腸黏膜胞質(zhì)中，表達(dá)的強度呈淡黃、黃色或棕黃色。給藥3周后，模型組大鼠結(jié)腸5-HT、SS、SP免疫組化的染色強度高于菝葜提取物低劑量組，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明了菝葜有效成分低劑量組可以降低模型大鼠結(jié)腸5-HT、SS、SP 免疫組化染色的表達(dá)。見 Fig 1、2、3。

Fig 1 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of 5-HT of C-IBS rats colon

Fig 2 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of substance P of C-IBS rats colon

Fig 3 Influnece of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of SS of C-IBS rats colon Note see Fig 1.

2.3 菝葜提取物對C-IBS大鼠脊髓SP免疫組化染色的影響 結(jié)果見Tab 3。與空白組相比，模型組脊髓SP免疫組化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組脊髓SP免疫組化染色的平均灰度值呈上升趨勢，其中陽性對照組和菝葜提取物低劑量組脊髓SP免疫組化染色的灰度平均值升高(P＜0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

Tab 3 Influence of extract of SmilaxChina L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats spinal cord(±s，n=8)

Tab 3 Influence of extract of SmilaxChina L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats spinal cord(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05 vs model group

Group SP Blank control group 166.90 ±5.59 Model group 148.60 ±14.7△△Active control group 158.30 ±7.94*High dose group 148.90 ±8.63 Middle dose group 148.91 ±8.64 Low dose group 158.20 ±8.34*

本實驗中脊髓SP的免疫組化染色散在的表達(dá)在腸粘膜胞質(zhì)中，表達(dá)的強度呈淡黃、黃色或棕黃色。給藥3周后，模型組大鼠脊髓SP免疫組化的染色強度高于低劑量組，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明了菝葜有效成分低劑量組可以降低模型大鼠脊髓SP免疫組化染色的表達(dá)。見Fig 4。

Fig 4 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of SP of C-IBS rats spinal cord

2.4 菝葜提取物對C-IBS大鼠結(jié)腸MC計數(shù)的影響 結(jié)果見Tab 4。與空白組相比，模型組結(jié)腸MC計數(shù)/視野升高(P＜0.01);與模型組相比，各給藥組MC計數(shù)/視野計數(shù)均呈下降趨勢，其中陽性對照組、菝葜提取物低劑量組MC計數(shù)/視野降低(P＜0.01，P＜0.05);菝葜提取物低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。

Tab 4 Influence of extract of Smilax China L.on counting of MCof C-IBS rats colon(±s，n=8)

Tab 4 Influence of extract of Smilax China L.on counting of MCof C-IBS rats colon(±s，n=8)

△△P ＜0.01 vs blank control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Counting of MC(Pcs/vision)Blank control group 5.23 ±0.61 Model group 6.13 ±0.91△△Active control group 5.30 ±0.42＊＊High dose group 6.08 ±0.16 Middle dose group 6.07 ±0.23 Low dose group 5.47 ±0.08*

3 討論

菝葜是被子植物門百合科菝葜屬植物，通常以根莖入藥，其功效是健脾益氣，溫腸止瀉。中醫(yī)對于菝葜在治療風(fēng)濕方面的論述較多，這一方面的作用也已被人所公認(rèn)。近年來，關(guān)于菝葜治療泄瀉、便秘等脾胃病方面的論述日益增多。本課題組自擬枳術(shù)菝葜飲治療老年慢性功能性便秘取得較好療效［3］。但只是涉及到了菝葜復(fù)方的臨床觀察，并未涉及菝葜提取物對C-IBS治療作用機(jī)制的研究。

另外本課題組發(fā)現(xiàn)，在色譜儀:美國DIONEX P680高效液相色譜儀，色譜柱:Venusil，XBP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm，博納愛杰爾科技有限公司);流動相:乙腈－水溶液(0～60 min乙腈比例5% ～100%);檢測波長為290 nm;柱溫:25℃;流速:1 ml·min－1;進(jìn)樣量:20 μl的色譜條件下對菝葜提取物的20%醇、50%醇、80%醇洗脫部位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菝葜總提取物20%、50%、80%醇大孔樹脂洗脫部位3者組分交叉較少，分離較完全，通過標(biāo)準(zhǔn)品落新婦苷進(jìn)行對比，落新婦苷主要存在于50%醇大孔樹脂洗脫部位中(Fig 5)。而近年來研究表明，落新婦苷具有多種生物學(xué)活性，包括鎮(zhèn)痛、消炎、殺菌、免疫等［4－6］，而這些藥理活性正好逐一針對著 IBS的內(nèi)臟高敏性、炎癥、神經(jīng)免疫機(jī)制和腸道菌群失調(diào)等各種發(fā)病機(jī)制。因此我們初步推測落新婦苷可能為菝葜提取物中治療C-IBS的單體成分之一。

Fig 5 Graph of high performance liquid chromatography(HPLC)of elution fraction group which is separated by different macroporous resin exchanger purification method from total extract of Smilax China L

C-IBS是一種較常見的消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。越來越多的研究表明，C-IBS的發(fā)生可能與神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素、免疫及神經(jīng)系統(tǒng)的平衡性失調(diào)有關(guān)。其中5-HT、SP、SS、MC可能參與到了IBS整個病理生理過程，可能相互作用、相互影響。5-HT作為一種廣泛存在的神經(jīng)遞質(zhì)，胃腸道中的5-HT可以影響胃酸分泌及胃腸肌電活動［7］。許多研究已經(jīng)證實5-HT信號系統(tǒng)發(fā)生異常可導(dǎo)致胃腸道動力及分泌功能異常，內(nèi)臟敏感性異常，與IBS的發(fā)病密切相關(guān)［8］。SP不僅是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，而且還是神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同的化學(xué)語言，是傳遞信息、調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)的重要信使［9］。SP 能引起整個胃腸道平滑肌的收縮［10］。SS是一種新提純的下丘腦多肽激素，因為其對生長激素(GH)的分泌抑制故而得名，在人體內(nèi)分布廣泛，血循環(huán)中的SS可能主要來自于胃腸道［11］。當(dāng)胃腸道中SS的含量高于正常水平時，則會使腸蠕動變緩。MC在胃腸道含量豐富，通過釋放如5-HT、NO、VIP等多種生物活性物質(zhì)來影響調(diào)節(jié)胃腸運動［12］。而來自腸分泌細(xì)胞的SS、SP等物質(zhì)也可以通過神經(jīng)分泌和旁分泌來調(diào)節(jié)MC的功能［13－14］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，菝葜提取物低劑量組可以降低模型組大鼠血清5-HT含量，降低血漿SS含量，升高血漿SP含量，可以減少模型組大鼠結(jié)腸MC計數(shù)，降低結(jié)腸5-HT、SS、SP、脊髓SP免疫組化染色強度的表達(dá)，說明該藥對C-IBS大鼠有一定的干預(yù)作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)整模型大鼠血清5-HT，血漿 SS、SP，結(jié)腸 5-HT、SP、SS、MC，脊髓 SP 等來實現(xiàn)的。

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