橘紅素增強5-氟尿嘧啶抑制人胃癌AGS細胞增殖的作用及其機制研究

魯 嵐，董 楊，施建蓉，吳大正

(上海中醫(yī)藥大學1.中藥研究所、2.上海市復(fù)方中藥重點實驗室、3.教學實驗中心，上海 201203)

5-氟尿嘧啶(5-Fu)是臨床常用的一線抗腫瘤藥物，尤其用于消化道腫瘤［1］。然而5-Fu可造成惡心、疲勞、血細胞減少以及心血管毒性等副作用卻限制了其臨床使用，因此降低使用劑量以減輕副作用對于5-Fu的推廣使用有重要意義［2－3］。近年來，與無毒的植物藥成分聯(lián)用增強5-Fu的抗腫瘤作用成為研究者關(guān)注的熱點［4］。橘紅素(Tangeretin)是一種存在于橘皮、枳實中的天然多甲氧基黃酮成分，已有研究報道橘紅素對多種腫瘤細胞如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等均有抑制作用，且沒有明顯細胞毒性［5－6］。本研究觀察橘紅素和小劑量5-Fu聯(lián)用對人AGS胃癌細胞增殖的抑制作用，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1細胞株人胃癌AGS細胞株購自美國ATCC(American Type Culture Collection)。

1.2藥物與試劑橘紅素(純度 ＞98%，批號:09102121)購自上海同田生物技術(shù)有限公司，5-氟尿嘧啶(5-Fu，批號:100410)為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。HAM's/F12培養(yǎng)基(批號:NVF0282)為Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清(批號:091214)購自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT(批號:091205)購自上海日初生物科技有限公司;碘化丙啶(PI，批號:118K3538)購自美國 Sigma公司;0.25%胰酶(批號:15050)購自美國 Gibco公司;ECL plus購自美國GE Healthcare公司;p21、p53、βactin一抗為美國CST公司產(chǎn)品。

1.3儀器Molecular Device SPECTERAmax 190酶標儀(美國)，BD FACSCalibur流式細胞儀(美國)，BRANSON超聲細胞破碎儀(美國)，Bio-Rad水平、垂直電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)人胃癌AGS細胞株接種于含10%胎牛血清的HAM's/F12培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT檢測對細胞抑制作用取對數(shù)生長期的AGS細胞，以1.0×107·L－1的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μl用培養(yǎng)液配制的5-Fu，橘紅素以及5-Fu和橘紅素聯(lián)合，對照組為培養(yǎng)液或0.05%DMSO，培養(yǎng)24 h 后，每孔加 MTT 20 μl(5 g·L－1)，4 h后棄上清，加入 150 μl DMSO 震蕩 10 min，酶標儀檢測570 nm的吸光度，實驗重復(fù)3次。抑制率/%=(1－受試藥 OD值/對照 OD值)×100%。

2.3流式細胞儀檢測細胞周期取對數(shù)生長期AGS細胞，以2.5×107·L－1的密度接種于6孔培養(yǎng)板，藥物作用24 h后收集細胞，無水乙醇(－20℃預(yù)冷)4℃固定過夜。含 EDTA的PBS洗3次，離心，500 μl PI(50 mg·L－1)避光染色30 min，流式細胞儀檢測分析。

2.4Western blot檢測蛋白表達藥物作用24 h后，收集細胞，加150 μl細胞裂解液，超聲粉碎，離心，取上清。分別取50 μg樣品蛋白/孔上樣，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)75 min(4℃，100 V)，5%脫脂奶粉封閉2h，然后分別用βactin(1∶1 000)、p21和p53(1∶500)一抗4℃平搖過夜，HRP標記二抗(1∶5 000)避光孵育2 h，ECL Plus顯色液顯色，顯影、定影，掃描條帶并行分析，以目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.5統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以±s表示。PrismDemo 4.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，one-way ANOVA和Dunnett檢驗進行多組比較。

3 結(jié)果

3.1橘紅素增強5-Fu抑制AGS細胞增殖的作用

觀察1、3、10、25、50、100、200 μmol·L－1濃度的5-Fu作用24 h對AGS胃癌細胞的作用。實驗結(jié)果顯示，OD值隨著藥物濃度的增加逐漸降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，藥物抑制率逐漸增強(Tab 1，F(xiàn)ig 1A)。本課題組前期研究表明，10、30、60 μmol·L－1橘紅素可呈劑量依賴地抑制AGS細胞生長，因此，本實驗觀察小劑量(10 μmol·L－1)和中劑量(30 μmol·L－1)橘紅素與 3 μmol·L－1小劑量5-Fu聯(lián)用對 AGS細胞增值的影響。結(jié)果顯示，10和 30 μmol·L－1橘紅素與 5-Fu聯(lián)用對AGS細胞增殖的抑制率分別為(42.0±5.3)%和(57.3±3.5)%，均高于5-Fu組(30.4±6.0)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。30 μmol·L－1橘紅素的增強作用更為明顯，因此選用此濃度做進一步的機制研究。見Fig 1B。

Tab 1 The OD570values of AGS cells exposed to 5-Fu at 24 h(±s，n=7)

Tab 1 The OD570values of AGS cells exposed to 5-Fu at 24 h(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 OD570 Control 0 0.762 ±0.083 5-Fu 1 0.625 ±0.025*3 0.512 ±0.043＊＊10 0.420 ±0.029＊＊25 0.374 ±0.049＊＊50 0.346 ±0.034＊＊100 0.344 ±0.026＊＊200 0.340 ±0.025＊＊

Fig 1 Tangeretin enhances the inhibiton of 5-Fu on the proliferation of AGS

3.2橘紅素聯(lián)合5-Fu對AGS細胞周期的影響作用24后，5-Fu組G1期細胞百分比高于對照組(P＜0.05)，橘紅素組S期細胞百分比高于對照組(P＜0.01)，而橘紅素聯(lián)合5-Fu組S期細胞所占百分比明顯增高，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，提示橘紅素聯(lián)合5-Fu可使AGS胃癌細胞阻滯于S期(Fig 2)。

3.3橘紅素聯(lián)合5-Fu對p53和p21蛋白表達的影響Western blot觀察橘紅素與5-Fu聯(lián)用對p53和p21蛋白表達的影響。實驗結(jié)果顯示，作用24 h，橘紅素與5-Fu聯(lián)用可明顯增強p53和p21蛋白的表達，且明顯高于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見Fig 3。

4 討論

5-Fu為一種抗代謝類抗腫瘤藥物，主要通過阻斷尿嘧啶脫氧核苷向胸腺嘧啶脫氧核苷的轉(zhuǎn)變影響細胞內(nèi)的DNA與RNA的合成 ，引起腫瘤細胞崩解、壞死，抑制腫瘤生長［7］。本研究表明，5-Fu可呈劑量依賴地抑制AGS胃癌細胞的增殖，但達到一定濃度，則抑制作用無明顯增加。以往研究也顯示［4，7］，隨著 5-Fu 濃度增加，其副作用明顯增強而抗腫瘤作用增加不再明顯。因此，通過與無毒的植物藥成分聯(lián)用增強5-Fu療效，進而降低其使用劑量以達到降低毒副作用的目的有著重要的臨床意義。本研究觀察到30 μmol·L－1橘紅素與小劑量5-Fu(3 μmol·L－1)聯(lián)用可明顯增強5-Fu抑制AGS胃癌細胞增殖的作用，與 100 μmol·L－15-Fu作用相當。因此，橘紅素可能作為一種增效劑用于5-Fu抗腫瘤治療的方案優(yōu)化。

腫瘤發(fā)生的主要原因是細胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細胞無限制增殖，因此，調(diào)控細胞周期是抑制腫瘤細胞增殖的重要途徑。本研究表明，5-Fu主要使AGS細胞阻滯于G1/M期，而橘紅素及與5-Fu聯(lián)用主要使細胞阻滯于S期，二者機制有所不同，這也可能二者聯(lián)用并未出現(xiàn)協(xié)同作用而只是增效作用的原因。S期檢查點的機制目前還不十分清楚，但有大量研究表明［8－9］許多化合物抑制腫瘤細胞增殖的作用均與S期阻滯有關(guān)。有研究表明［10］哇巴因和華蟾毒配基可使肝癌HepG2細胞p21CIP1表達上調(diào)引起細胞周期S期阻滯。本研究也發(fā)現(xiàn)，橘紅素和5-Fu聯(lián)用可明顯增強p53和p21Cip1/Waf1表達。AGS胃癌細胞系屬p53野生型細胞系，野生型p53基因為抑癌基因，細胞受損后，p53可上調(diào)p21表達，從而抑制Cyclin-CDK對Rb蛋白的磷酸化作用，使細胞發(fā)生 S期阻滯［11－12］。綜上所述，橘紅素和5-Fu聯(lián)用可明顯增強5-Fu抑制人胃癌AGS細胞增殖的作用，主要機制可能是通過上調(diào)p53和p21蛋白使AGS胃癌細胞阻滯于S期。

Fig 2 Effect of tangeretin combined with 5-Fu on AGS cell cycle distribution(n=3)

Fig 3 Effects of tangeretin combined with 5-Fu on p53(A)and p21(B)protein expression(n=3)

［1］Pinedo H M，Peters G F.Fluorouracil:biochemistry and pharmacology［J］.J Clin Oncol，1988，6(10):1653 － 64.

［2］Delval L，Klastersky J.Optic neuropathy in cancer patients.Report of a case possibly related to 5 fuorouracil toxicity and review of the literature［J］.J Neurooncol，2002，60(2):165 －9.

［3］Viale P H，Yamamoto D S.Cardiovascular toxicity associated with cancer treatment［J］.Clin J Oncol Nurs，2008，12(4):627 －38.

［4］Li X L，Wang C Z，Mehendale S R，et al.Panaxadiol，a purified ginseng component，enhances the anti-cancer effects of 5-fluorouracil in human colorectal cancer cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2009，64(6):1097 －104.

［5］Pan M H，Chen W J，Lin-Shiau S Y，et al.Tangeretin induces cell-cycle G1arrest through inhibiting cyclin-dependent kinases 2 and 4 activities as well as elevating Cdk inhibitors p21 and p27 in human colorectal carcinoma cells［J］.Carcinogenesis，2002，23(10):1677－84.

［6］Morley K L，F(xiàn)erguson P J，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2007，251(1):168 －78.

［7］黃海濤，姜 茹，牛銀波，等.5-氟尿嘧啶衍生物的合成及其體外抗腫瘤活性研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(11):1481－4.

［7］Huang H T，Jiang R，Niu Y B，et al.Synthesis of 5-fluorouracil derivative and its antitumor activitiesin vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(11):1481 －4.

［8］Iguchi T，Miyakawa Y，Saito K，et al.Zoledronate-induced S phase arrest and apoptosis accompanied by DNA damage and activation of the ATM/Chk1/cdc25 pathway in human osteosarcoma cells［J］.Int J Oncol，2007，31(2):285 － 91.

［9］Zhu H，Zhang L，Wu S，et al.Induction of S-phase arrest and p21 overexpression by a small molecule 2［［3-(2，3-dichlorophenoxy)propyl］amino］ethanol in correlation with activation of ERK［J］.Oncogene，2004，23(29):4984 －92.

［10］高默杰，徐忠偉，王鳳梅，等.鈉鉀泵抑制劑通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的生成介導(dǎo)肝癌HepG2細胞周期S期阻滯與凋亡［J］.中國藥理學通報，2010，26(4):452 －6.

［10］Gao M J，Xu Z W，Wang F M，et al.The linkage between cell cycle S phase arrest and apoptosis on human hepatocellular carcinoma HepG2 induced by Na+，K+-ATPase inhibitors via regulating proteins associated with cell cycle［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):452 －6.

［11］董 楊，季 光，曹愛麗，等.甜橙黃酮對人胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用及其機制研究［J］.中國中藥雜志，2011，36(5):印刷中.

［11］Dong Y，Ji G，Cao A L，et al.Effects of sinensetin on proliferation and apoptosis of human gastric cancer AGS cells［J］.Chin J Chin Mater Med，2011，36(5):in print.

［12］王 澈，李 崧，王敏偉.吳茱萸堿在誘導(dǎo)人黑色素瘤A375-S2細胞凋亡過程中對SIRT1和p53蛋白的影響［J］.沈陽藥科大學學報，2007，24(1):45－8.

［12］Wang C，Li S，Wang M W.Influences on SIRT1 and p53 in evodiamine-induced apoptosis in human melanoma A375-S2 cells［J］.J Shenyang Pharm Univ，2007，24(1):45 －8.